Summary

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Published: September 28, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle Assay, den Beitrag der spezifischen Proteins Domänen der Plasmamembran Rezeptoren Enzym Rekrutierung und Enzym-Aktivität gleichzeitig zu studieren.

Abstract

Rezeptor-assoziierten Enzyme sind die wichtigsten Vermittler der zellulären Aktivierung. Diese Enzyme sind mindestens im Teil, durch die physikalischen Wechselwirkungen mit zytoplasmatischen Schwänzen der Rezeptoren geregelt. Die Interaktionen oft durch spezifisches Protein Domänen auftreten und Aktivierung der Enzyme führen. Es gibt mehrere Methoden, um Interaktionen zwischen Proteinen zu untersuchen. Während co-Immunopräzipitation häufig verwendet, um Domänen zu studieren, die für Protein-Protein-Wechselwirkungen erforderlich sind, gibt es keine Tests dieses Dokument den Beitrag von bestimmten Domänen zur Aktivität der rekrutierten Enzyme zur gleichen Zeit. Die hier beschriebene Methode kombiniert dementsprechend co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle-Assay für simultane Auswertung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen und damit verbundenen enzymatische Aktivierung. Das Ziel dieses Protokolls ist, die Domains zu identifizieren, die sind entscheidend für die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Protein und Enzym und Domänen, die für die vollständige Aktivierung des Enzyms obligatorisch sind. Die Bedeutung des Assays gezeigt, als bestimmten Rezeptor Protein Domänen dazu beitragen, die Bindung des Enzyms der cytoplasmatischen Schwanz des Rezeptors, während andere Bereiche sind notwendig, um die Funktion des gleichen Enzyms zu regulieren.

Introduction

Katalytische Rezeptoren und Rezeptor-Tyrosin-Kinasen sind transmembrane Proteine in die Bindung eines extrazellulären Liganden enzymatische Aktivität auf die intrazelluläre Seite1verursacht. Einige Rezeptoren besitzen Rezeptor und enzymatische Funktionen, während andere spezifische Enzyme wie Kinasen und Phosphatasen zu ihre cytoplasmatischen Tails zu rekrutieren. Rekrutierung eines Enzyms an den Rezeptor Tail und die anschließende katalytische Wirkung dieses Enzyms sind zwei separate Prozesse, die nicht immer von der gleichen Protein Domänen2geregelt sind. Leider gibt es keine spezifische Werkzeuge, um das Zusammenspiel und die enzymatische Aktivität gleichzeitig zu beurteilen. Hier beschriebenen funktionellen co-Immunopräzipitation-Assay ist eine nützliche Methode, um die Rekrutierung eines Enzyms am Schwanz eines Rezeptors aus seiner Aktivierung zu sezieren. Dieser Assay nutzt Immunopräzipitation tagged Rezeptoren durch Antikörper-beschichtete Perlen. Anschließend erfolgt eine enzymatische Aktivität Assay und western-Blot-Analyse auf Perlen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist zu entdecken, welche Protein-Domains für Interaktionen zwischen Rezeptoren und Enzymen (bewertet von western-Blot Analyse) notwendig sind und welche Domains sind verbindlich für die vollständige Aktivierung der Enzyme (gemessen am Wulst enzymatische Aktivität Assay). Es ist bezeichnend, Werkzeuge für das Studium der getrennten Funktionen der Rezeptor-assoziierten Enzyme aufgrund ihrer Beteiligung an der Pathogenese von Krankheiten des Menschen zu entwickeln. Weitere Verständnis der Wirkmechanismen dieser Proteine kann darüber hinaus die Gestaltung der neue therapeutische Interventionen helfen.

Programmierten Tod-1 (PD-1) ist eine inhibitorische Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen und ist erforderlich für die Begrenzung der übermäßige T-Zell-Reaktionen. In den letzten Jahren haben Anti-PD-1 Antikörper bei der Behandlung von mehreren Malignome1,2verwickelt. PD-1 Ligatur hemmt zahlreiche T-Zell-Funktionen, einschließlich der Proliferation, Haftung und Sekretion von mehrere Zytokine3,4,5. PD-1 ist auf der immunologischen Synapse, die Schnittstelle zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen6, lokalisiert, wo es mit dem T-Zell-Rezeptor (TCR)7colocalizes. Anschließend die Tyrosin-Phosphatase SHP2 [Src Homologie 2 (SH2) Domäne mit Tyrosin Phosphatase 2] wird der cytoplasmatischen Schwanz des PD-1, führt zu wichtigen Tyrosin Rückstände innerhalb der TCR komplex und die damit verbundenen proximalen dephosphorylation rekrutiert Signalisierung Moleküle3,4,5,8,9. Die zytoplasmatischen Schweif von PD-1 enthält zwei Tyrosin Motive, ein Immunoreceptor Tyrosin-basierte hemmenden Motiv (ITIM) und eine Immunoreceptor Tyrosin basierend-Schalter Motiv (ITSM)10. Beide Motive sind auf PD-1 Ligatur9,10phosphoryliert. Mutagenese Studien ergaben eine primäre Rolle für die ITSM im SHP2 Einstellung, im Gegensatz zu den ITIM, deren Rolle in der PD-1 Signal- und Funktion nicht klar ist4.

SHP2 nimmt entweder eine geschlossene (gefaltet), Konformation oder eine offene (verlängert), aktive Konformation11gehemmt. Der Beitrag der jeweiligen Tail-Domäne von PD-1 SHP2 Bindung oder Aktivierung ist noch nicht aufgeklärt. Um diese Frage zu beantworten, haben wir eine Probe, die es ermöglicht parallele Prüfung der Einstellung von SHP2 am Schwanz des PD-1 und seine Aktivität12entwickelt. Wir Beschäftigten co-Immunopräzipitation und eine auf Perle Phosphatase Aktivität Assay, das Zusammenspiel und die Enzymaktivität parallel zu testen. Mit Hilfe dieser Assay, zeigen wir, dass die ITSM PD-1 ausreichend ist, um SHP2 am Schwanz des PD-1, während die ITIM PD-1 erforderlich ist, um vollständig zu erweitern und aktivieren das Enzym zu rekrutieren.

Es gibt viele Rezeptoren, die einige angrenzende Gebiete in den zytoplasmatischen Schwänzen haben. Die funktionale co-Immunopräzipitation-Assay kann die Rolle von bestimmten Domänen aufzudecken, die für Protein Rekrutierung oder enzymatische Aktivierung notwendig sind.

Protocol

1. die Transfektion von Zellen Samen Sie HEK 293T Zellen in zwölf 10 cm Teller (5 x 106 Zellen pro Platte) am Vortag Transfektion (Abbildung 1). Führen Sie die Zellzählung mit einem Hemocytometer. Verwenden Sie für jede Platte 10 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in 5 % CO2. Sobald die Zellen 80-90 % Zusammenfluss sind, transfizieren 5 HEK 293T Platten mit einem Lipid-basierte Transfe…

Representative Results

Der Beitrag von ITSM PD-1 SHP2 Bindung festgelegt ist, ist die Rolle von ITIM PD-1 weniger klar. Da SHP2 zwei SH2-Domänen, die an zwei sequentielle Phosphotyrosines PD-1 (ein Tyrosin in den ITSM) und ein weiteres in der ITIM binden können verfügt, wir vermutet, dass die ITSM PD-1 SHP2 PD-1, Anker während die ITIM PD-1 SHP2 Aktivität durch die Stabilisierung erleichtert der Öffnen Sie conformational Zustand11,14. Um dies zu t…

Discussion

Rezeptor-Enzym Interaktionen sind entscheidend für die intrazelluläre Signalisierung. Viele Enzyme werden rekrutiert, an Rezeptoren durch SH2-Domänen binden an phosphorylierten Tyrosines, die Enden von den gleichen Rezeptoren zu schmücken. Jedoch Enzyme sind oft in geschlossenen inaktive Konformationen gefaltet und Aktivierung erfordert eine Konformationsänderung11 , die von anderen Domänen die gleichen Rezeptor vermittelt werden können. Der Test beschriebenen hier Maßnahmen, die die Wechs…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien 1R01AI125640-01 und der Rheumatologie Research Foundation finanziert.

Materials

PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 ml
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

References

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).

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Citer Cet Article
Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

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