Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים
Summary
כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.
Abstract
אנזימים הקשורים קולטן הם המתווכים העיקריים של הפעלה סלולרית. אנזימים אלה מוסדרים, לפחות בחלקו, על ידי אינטראקציות גופניות עם זנבות cytoplasmic של קולטני. האינטראקציות לעיתים קרובות להתרחש דרך חלבון ספציפי תחומים, לגרום ההפעלה של האנזימים. ישנן מספר שיטות ללמוד אינטראקציות בין חלבונים. בעוד co-immunoprecipitation משמש בדרך כלל כדי ללמוד תחומים הנדרשים עבור אינטראקציות חלבון-חלבון, ישנם מבחני אין מסמך זה התרומה של תחומים ספציפיים לפעילות של אנזימים מגויסים באותו זמן. בהתאם לכך, השיטה המתוארת כאן משלב co-immunoprecipitation וזמינותו פעילות אנזימטי על חרוזי להערכה סימולטני של אינטראקציות בין חלבונים והפעלה אנזימטי המשויך. המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות את התחומים הם קריטיים עבור אינטראקציות גופניות בין חלבון לבין האנזים על התחומים שאינם חובה להפעלה מלאה של האנזים. הוכח את החשיבות של זה וזמינותו, בתור קולטן מסוים חלבון תחומים לתרום הכריכה של האנזים ועד הזנב cytoplasmic של הקולטן, בעוד תחומים אחרים נדרשים להסדיר את הפונקציה של אותו אנזים.
Introduction
קולטנים קטליטי קולטן טירוזין kinases חלבונים transmembrane שבו איגוד של ליגנד חוץ-תאית גורמת פעילות אנזימטי הצד תאיים1בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. קולטנים מסוימים בעלי קולטן והן פונקציות אנזימטיות, בעוד אחרים לגייס אנזימים מסוימים כגון kinases ו- phosphatases כדי cytoplasmic הזנבות שלהם. גיוס של אנזים הזנב הקולטן ואת הפעולה קטליטי עוקבות של האנזים הזה הם שני תהליכים נפרדים שמווסתים לא תמיד על-ידי אותו חלבון תחומים2. למרבה הצער, אין כלים ספציפיים כדי להעריך את האינטראקציה ואת פעילות אנזימטי בו זמנית. וזמינותו פונקציונלי co-immunoprecipitation המתוארים כאן היא שיטה שימושית לנתח הגיוס של אנזים ועד הזנב של קולטן מהפעלה שלה. זה וזמינותו מנצל immunoprecipitation של קולטני שתייגת על ידי חרוזים מצופים נוגדן. לאחר מכן, מבוצעות assay אנזימטי פעילות והן תספיג ניתוח על חרוזים. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לחשוף אילו תחומים חלבון הכרחיות עבור אינטראקציות בין קולטנים ואנזימים (מוערך על ידי ניתוח תספיג), אילו תחומים הם חובה הפעלה מלאה של האנזימים (נמדדת בחרוז assay אנזימטי פעילות). היא משמעותית לפתח כלי לימוד הפונקציות נפרדים של אנזימים הקשורים קולטן בשל מעורבותם בפתוגנזה של מחלות אנושיות. יתר על כן, עוד יותר להבין את מנגנוני הפעולה של חלבונים אלו עשוי לסייע בעיצוב של הרומן התערבויות טיפוליות.
מוות מתוכנת-1 (PD-1) הוא קולטן המעכבת על פני השטח של תאי T והוא נדרש עבור הגבלת תגובות תא T מוגזמת. בשנים האחרונות, היו מעורבים נוגדנים anti-PD-1 בטיפול של ממאירות מספר1,2. PD-1 מצדו ומרסן פונקציות תא T רבים, לרבות הפצה, הדבקה הפרשת ציטוקינים מספר3,4,5. PD-1 הוא מקומי כדי הסינפסה חיסוניות, הממשק בין תאי T אנטיגן תאים6, איפה זה colocalizes עם תא T-קולטן (TCR)7. לאחר מכן, טירוזין phosphatase SHP2 [Src הומולוגיה 2 (SH2) תחום המכיל טירוזין phosphatase 2] הוא גויס אל זנב cytoplasmic PD-1, המוביל dephosphorylation של שאריות טירוזין מפתח בתוך TCR את מורכבות, המשויך צינתור איתות מולקולות3,4,5,8,9. זנב cytoplasmic PD-1 מכיל שני מוטיבים טירוזין immunoreceptor המבוסס על טירוזין מעכבות מוטיב (עתים), מבוסס-switch מוטיב (ITSM) של טירוזין immunoreceptor10. שני מוטיבים הם phosphorylated על PD-1 מצדו9,10. מוטגנזה מכוונת מחקרים גילו לתפקיד הראשי עבור ITSM גיוס, בניגוד עתים, שתפקידו PD-1 איתות ומתפקדים לא ברור SHP24.
SHP2 מאמצת או מסוגרת (מקופל), עכבות קונפורמציה או פתוח (מורחב), פעיל קונפורמציה11. לא הובהר כבר התרומה של כל תחום הזנב של PD-1 SHP2 מחייב או הפעלה. כדי לענות על שאלה זו, פיתחנו וזמינותו המאפשרת בדיקה מקבילה של הגיוס של SHP2 אל זנב PD-1 ושלה פעילות12. אנחנו מועסקים co-immunoprecipitation ואת וזמינותו פעילות בחרוז פוספטאז לבחון את האינטראקציה ואת פעילות אנזימטי במקביל. שימוש assay הזה, אנו מראים כי ITSM של PD-1 מספיקה לגייס SHP2 אל זנב PD-1, בעוד עתים של PD-1 יש צורך להרחיב ולהפעיל את האנזים באופן מלא.
ישנם רצפטורים רבים שיש להם מספר תחומים סמוכים באזור הזנבות cytoplasmic שלהם. וזמינותו פונקציונלי co-immunoprecipitation יכול לחשוף את התפקיד של תחומים ספציפיים הנחוצים עבור גיוס חלבון או הפעלת אנזימטיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
קולטן-אנזים אינטראקציות מכריעים עבור מערכת אזעקה תאיים. אנזימים רבים גייסו לקולטנים באמצעות תחומים SH2 מחייב את tyrosines phosphorylated המעטרים זנבות של קולטני אותו. עם זאת, אנזימים מקופלים לעתים קרובות לתוך הייצורים החיים לא פעיל סגור, ודורש הפעלה לשינוי הסתגלותי11 זה יכול להיות מתווכת …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH 1R01AI125640-01 ושל קרן מחקר ראומטולוגיה.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
