सह रिसेप्टर्स और एंजाइमों के बीच कार्यात्मक बातचीत का अध्ययन करने के लिए immunoprecipitation परख
Summary
यहां, हम सह के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान immunoprecipitation और एक पर-मनका एंजाइमी गतिविधि परख के लिए एक साथ प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स के विशिष्ट प्रोटीन डोमेन के योगदान का अध्ययन दोनों एंजाइम भर्ती और एंजाइम गतिविधि ।
Abstract
रिसेप्टर-संबद्ध एंजाइमों सेलुलर सक्रियण के प्रमुख मध्यस्थों हैं. इन एंजाइमों विनियमित रहे हैं, कम से कम भाग में, रिसेप्टर्स की cytoplasmic पूंछ के साथ शारीरिक बातचीत से. बातचीत अक्सर विशिष्ट प्रोटीन डोमेन और एंजाइमों के सक्रियकरण में परिणाम के माध्यम से होते हैं । वहां प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए कई तरीके हैं । जबकि सह immunoprecipitation सामांयतः डोमेन है कि प्रोटीन के लिए आवश्यक है अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाता है प्रोटीन बातचीत, वहां कोई परख रहे है कि दस्तावेज एक ही समय में भर्ती एंजाइमों की गतिविधि के लिए विशिष्ट डोमेन का योगदान । तदनुसार, विधि यहां वर्णित सह immunoprecipitation और एक पर-मनका एंजाइमी प्रोटीन और संबंधित एंजाइमी सक्रियण के बीच बातचीत के एक साथ मूल्यांकन के लिए गतिविधि परख को जोड़ती है । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि एक प्रोटीन और एंजाइम और डोमेन है कि एंजाइम की पूरी सक्रियण के लिए अनिवार्य कर रहे है के बीच शारीरिक बातचीत के लिए महत्वपूर्ण है डोमेन की पहचान करने के लिए है । इस परख के महत्व का प्रदर्शन किया है, के रूप में कुछ रिसेप्टर प्रोटीन डोमेन रिसेप्टर के cytoplasmic पूंछ करने के लिए एंजाइम के बंधन में योगदान है, जबकि अन्य डोमेन के लिए एक ही एंजाइम के समारोह को विनियमित करने के लिए आवश्यक हैं.
Introduction
उत्प्रेरक रिसेप्टर्स और रिसेप्टर tyrosine kinases transmembrane प्रोटीन है जिसमें एक extracellular ligand के बंधन एंजाइमी ओर1पर intracellular गतिविधि का कारण बनता है । कुछ रिसेप्टर्स दोनों रिसेप्टर और एंजाइमी कार्यों के अधिकारी, जबकि दूसरों को अपने cytoplasmic पूंछ के लिए इस तरह के kinases और phosphatases के रूप में विशिष्ट एंजाइमों की भर्ती. रिसेप्टर की पूंछ के लिए एक एंजाइम की भर्ती और इस एंजाइम के बाद उत्प्रेरक कार्रवाई दो अलग प्रक्रियाओं है कि हमेशा एक ही प्रोटीन डोमेन2द्वारा विनियमित नहीं कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, एक साथ बातचीत और एंजाइमी गतिविधि दोनों का आकलन करने के लिए कोई विशिष्ट उपकरण हैं । कार्यात्मक सह immunoprecipitation परख यहां वर्णित एक उपयोगी तरीका है अपने सक्रियण से एक रिसेप्टर की पूंछ के लिए एक एंजाइम की भर्ती काटना है । इस परख एंटीबॉडी-लेपित मोतियों से टैग रिसेप्टर्स के immunoprecipitation का इस्तेमाल करता है । बाद में, दोनों एक एंजाइमी गतिविधि परख और मोतियों पर पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रदर्शन कर रहे हैं । इस विधि के समग्र लक्ष्य को उजागर करने के लिए जो प्रोटीन डोमेन रिसेप्टर्स और एंजाइमों के बीच बातचीत के लिए आवश्यक हैं (पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन) और जो डोमेन एंजाइमों की पूरी सक्रियण के लिए अनिवार्य कर रहे हैं (पर से मापा-मनका एंजाइमी गतिविधि परख) । यह रिसेप्टर के अलग कार्यों का अध्ययन करने के लिए उपकरण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है-जुड़े एंजाइमों मानव रोगों के रोगजनन में उनकी भागीदारी के कारण. इसके अलावा, आगे इन प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र को समझने के उपंयास चिकित्सीय हस्तक्षेप के डिजाइन में मदद कर सकते हैं ।
क्रमादेशित मृत्यु-1 (पीडी-1) टी कोशिकाओं की सतह पर एक निरोधात्मक रिसेप्टर है और अत्यधिक टी सेल प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए आवश्यक है. हाल के वर्षों में, विरोधी पीडी-1 एंटीबॉडी एकाधिक द्रोह1,2के उपचार में फंसाया गया है । पीडी-1 बंधाव प्रसार, आसंजन, और कई साइटोकिंस3,4,5के स्राव सहित कई टी सेल कार्यों को नियंत्रित करता है । पीडी-1 प्रतिरक्षा synapse, टी कोशिकाओं और प्रतिजन के बीच इंटरफेस-6कोशिकाओं को पेश करने के लिए स्थानीयकृत है, जहां यह टी सेल रिसेप्टर (TCR)7के साथ colocalizes. इसके बाद, tyrosine फॉस्फेट SHP2 [Src समरूपता 2 (SH2) डोमेन युक्त tyrosine फॉस्फेट 2] पीडी-1 की cytoplasmic पूंछ के लिए भर्ती है, dephosphorylation परिसर और उससे जुड़े समीपस्थ के भीतर प्रमुख tyrosine अवशेषों के TCR के लिए अग्रणी अणुओं3,4,5,8,9संकेत । पीडी-1 के cytoplasmic टेल दो tyrosine रूपांकनों, एक immunoreceptor tyrosine आधारित निरोधात्मक आकृति (इति॒), और एक immunoreceptor tyrosine आधारित-स्विच आकृति (आईटीएसएम)10शामिल हैं । दोनों रूपांकनों पीडी-1 बंधाव9,10पर phosphorylated हैं । Mutagenesis स्टडीज में SHP2 भर्ती में आईटीएसएम के लिए एक प्राथमिक भूमिका का पता चला है, के रूप में इति॒, पीडी-1 संकेतन और समारोह में जिनकी भूमिका4स्पष्ट नहीं है ।
SHP2 को गोद ले या तो एक बंद (मुड़ा हुआ), बाधित रचना या एक खुला (विस्तारित), सक्रिय अनुरूपता11. SHP2 बाइंडिंग या सक्रियण के लिए पीडी-1 के प्रत्येक टेल डोमेन के योगदान का अभी तक आविर्भाव नहीं हुआ है । इस सवाल का जवाब देने के लिए, हम एक परख है कि SHP2 की भर्ती के समानांतर परीक्षण पीडी-1 की पूंछ और अपनी गतिविधि12में सक्षम बनाता है विकसित की है । हम सह immunoprecipitation और एक पर-मनका फॉस्फेट गतिविधि परख कार्यरत दोनों बातचीत और समानांतर में एंजाइमी गतिविधि का परीक्षण । इस परख का उपयोग हम बताते हैं कि पीडी-1 की आईटीएसएम को पीडी-1 की टेल तक SHP2 भर्ती करने के लिए पर्याप्त है, जबकि पीडी-1 के इति॒ को पूरी तरह से बढ़ाने और एंजाइम को एक्टिवेट करने की जरूरत है ।
वहां कई रिसेप्टर्स कि उनके cytoplasmic पूंछ में कई आसंन डोमेन है । कार्यात्मक सह immunoprecipitation परख विशिष्ट डोमेन है कि या तो प्रोटीन भर्ती या एंजाइमी सक्रियण के लिए आवश्यक है की भूमिका को उजागर कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
रिसेप्टर-एंजाइम बातचीत intracellular संकेतन के लिए महत्वपूर्ण हैं. कई एंजाइमों SH2 phosphorylated tyrosines के लिए बाध्यकारी डोमेन के माध्यम से रिसेप्टर्स के लिए भर्ती कर रहे हैं कि एक ही रिसेप्टर्स की पूंछ को सजाने. हालांकि, एं…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को NIH अनुदान 1R01AI125640-01 और संधिवातीयशास्त्र रिसर्च फाउंडेशन द्वारा वित्तपोषित किया गया था ।
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
