Co-immunoprecipitation analysen for å studere funksjonell samhandling mellom reseptorer og enzymer
Summary
Her presenterer vi en protokoll for co-immunoprecipitation og på-perle enzymatisk aktivitet analysen samtidig studere bidrag av bestemt protein domener av plasma membran reseptorer både enzym rekruttering og enzym aktivitet.
Abstract
Reseptor-assosiert enzymer er store meklere av aktivering. Disse enzymene er regulert, minst delvis av fysisk interaksjon med cytoplasmiske hale av reseptorer. Samhandlinger som ofte oppstår gjennom bestemt protein domener og føre aktivering av enzymer. Det finnes flere metoder til å studere samspillet mellom proteiner. Mens co-immunoprecipitation brukes vanligvis til å studere domener som kreves for protein-protein interaksjoner, er det ingen analyser dokumentet bidraget fra bestemte domener til aktivitet av rekruttert enzymer samtidig. Følgelig kombinerer metoden beskrevet her co-immunoprecipitation og på-perle enzymatisk aktivitet analysen for samtidige evaluering av samspillet mellom proteiner og tilknyttede enzymatisk aktivisering. Målet med denne protokollen er å identifisere domenene som er kritiske for fysisk interaksjon mellom et protein enzym og domenene som er obligatorisk for full aktivering av enzym. Betydningen av denne analysen er demonstrert, som enkelte reseptor protein domener bidrar til binding av enzymet til cytoplasmiske hale av reseptoren, mens andre domener er nødvendig å regulere funksjon av det samme enzymet.
Introduction
Katalytisk reseptorer og receptor tyrosine kinaser er transmembrane proteiner som forårsaker binding av en ekstracellulære ligand enzymatisk aktivitet på intracellulær siden1. Noen reseptorer har både reseptor og enzymatiske funksjoner, mens andre rekruttere spesielle enzymer som kinaser og phosphatases til cytoplasmiske halen. Rekruttering av et enzym reseptorens halen og påfølgende katalytiske handlingen av dette enzymet er to separate prosesser som ikke alltid er regulert av den samme protein domener2. Dessverre er det ingen spesifikke verktøy å vurdere både samhandling og enzymatiske aktiviteten samtidig. Funksjonell co-immunoprecipitation analysen beskrevet her er en nyttig metode for å analysere rekruttering av et enzym på halen av en reseptor fra aktivering sin. Denne analysen benytter immunoprecipitation av merket reseptorer av antistoff perler. Deretter utføres en enzymatisk aktivitet analysen og western blot analyse på perler. Det overordnede målet med denne metoden er å avdekke hvilke protein domener er nødvendig for kommunikasjon mellom reseptorer og enzymer (vurdert ved western blot analyse) og hvilke domener er obligatorisk for full aktivering av enzymer (målt ved på-perle enzymatisk aktivitet analysen). Det er viktig å utvikle verktøy for å studere de separate funksjonene av reseptor-assosiert enzymer på grunn av deres engasjement i patogenesen av menneskelige sykdommer. Videre kan videre forståelse virkningsmekanismer av disse proteinene bidra til utformingen av romanen terapeutisk intervensjon.
Programmert død-1 (PD-1) er en hemmende reseptor på overflaten av T-celler og er nødvendig for å begrense overdreven T celle svar. De siste årene, har anti-PD-1 antistoffer vært medvirkende i behandlingen av flere malignitet1,2. PD-1 ligation begrenser tallrike T celle-funksjoner, inkludert spredning, vedheft og sekresjon av flere cytokiner3,4,5. PD-1 er lokalisert til immunologiske synapse, grensesnittet mellom T celler og antigen-presentasjon celler6, der det colocalizes med T-celle reseptor (TCR)7. Deretter tyrosin fosfatase SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domenet som inneholder tyrosin fosfatase 2] rekruttert til cytoplasmiske hale av PD-1, fører til dephosphorylation av viktige tyrosin rester TCR komplekset og assosierte proksimale signalnettverk molekyler,3,,4,,5,,8,,9. Cytoplasmiske halen av PD-1 inneholder to tyrosin motiver, en immunoreceptor tyrosin-baserte hemmende motiv (svart) og en immunoreceptor tyrosin basert-bryteren motiv (ITSM)10. Både motiver er fosforylert på PD-1 ligation9,10. Mutagenese undersøkelser avdekket en primær rolle for ITSM i SHP2 rekruttering, i motsetning til svart, hvis rolle i PD-1 signalering og funksjon ikke er klart4.
SHP2 vedtar enten en lukket (kastet), hemmet conformation eller en åpen (utvidet), aktiv konformasjon11. Bidraget fra hver hale domenet av PD-1 SHP2 binding eller aktivisering har ennå ikke utredet. For å besvare dette spørsmålet, utviklet vi en analyse som gjør parallelle testing av rekrutteringen av SHP2 på halen av PD-1 og dens aktivitet12. Vi ansatt co-immunoprecipitation og på-perle fosfatase aktivitet analysen å teste både samhandling og enzymatiske aktiviteten i parallell. Bruker denne analysen, viser vi at ITSM av PD-1 er tilstrekkelig å rekruttere SHP2 på halen av PD-1, mens svart av PD-1 er nødvendig å fullt utvide og aktiverer enzymet.
Det er mange reseptorer som har flere tilstøtende domener i cytoplasmiske halen. Funksjonell co-immunoprecipitation analysen kan avdekke rollen til bestemte domener som er nødvendige for protein rekruttering eller enzymatisk aktivisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reseptor-enzym interaksjoner er avgjørende for intracellulær signalering. Mange enzymer er rekruttert til reseptorer gjennom SH2 domener binding til fosforylert tyrosines som dekorerer haler av samme reseptorer. Imidlertid er enzymer ofte i lukket inaktive konformasjonen, og aktivering krever en conformational endring11 som kan være formidlet av andre domener av samme reseptoren. Analysen beskrevet her tiltak samspillet mellom reseptorer og enzymer som aktiviteten indusert av disse interaksjone…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble finansiert av NIH tilskudd 1R01AI125640-01 og Rheumatology Research Foundation.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
