Co-imunoprecipitação ensaio para estudar interações funcionais entre receptores e enzimas
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade enzimática em grânulo para estudar simultaneamente a contribuição de domínios da proteína específica dos receptores de membrana plasmática ao recrutamento de enzima e atividade enzimática.
Abstract
Receptores associados a enzimas são os principais mediadores de ativação celular. Estas enzimas são regulamentadas, pelo menos em parte, pelas interações físicas com cauda citoplasmática dos receptores de. As interações frequentemente ocorrem através de domínios da proteína específica e resultam em ativação das enzimas. Existem vários métodos para estudar as interações entre proteínas. Enquanto co-imunoprecipitação é comumente usado para estudar os domínios que são necessários para interações da proteína-proteína, existem ensaios sem esse documento a contribuição de domínios específicos para a atividade das enzimas recrutadas ao mesmo tempo. Por conseguinte, o método descrito aqui combina co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade enzimática em grânulo para avaliação simultânea das interações entre proteínas e associado da ativação enzimática. O objetivo do presente protocolo é identificar os domínios que são críticos para interações físicas entre uma proteína e enzima e os domínios que são obrigatórios para a completa ativação da enzima. A importância deste teste é demonstrada, como receptor de certo domínios da proteína contribuem para a ligação da enzima para a cauda citoplasmática do receptor, enquanto outros domínios são necessários para regular a função da mesma enzima.
Introduction
Receptores catalíticos e quinase de tirosina do receptor é proteínas transmembrana, na qual a ligação de um ligante extracelular causa atividade enzimática no intracelular lado1. Alguns receptores possuem tanto receptor e funções enzimáticas, enquanto outros recrutam enzimas específicas tais como quinases e fosfatases para sua cauda citoplasmática. Recrutamento de uma enzima, a cauda do receptor e a subsequente ação catalítica desta enzima são dois processos separados que não são sempre regulados pela mesma proteína domínios2. Infelizmente, não há nenhum ferramentas específicas para avaliar a interação e a atividade enzimática em simultâneo. O ensaio funcional co-imunoprecipitação descrito aqui é um método útil para dissecar o recrutamento de uma enzima para a cauda de um receptor de sua ativação. Este ensaio utiliza imunoprecipitação de receptores marcados por grânulos revestidos de anticorpo. Posteriormente, um ensaio de atividade enzimática e análise ocidental do borrão em grânulos são executadas. O objectivo geral deste método é para descobrir quais domínios da proteína são necessários para interações entre receptores e enzimas (avaliadas pela análise ocidental do borrão) e os domínios são obrigatórios para a ativação completa das enzimas (medido por no grânulo ensaio de atividade enzimática). É significativo desenvolver ferramentas para estudar as funções separadas de enzimas associadas do receptor, devido ao seu envolvimento na patogênese de doenças humanas. Além disso, ainda mais, compreender os mecanismos de ação dessas proteínas pode ajudar a concepção de novas intervenções terapêuticas.
Morte programada-1 (PD-1) é um receptor inibitório na superfície de células T e é necessário para limitar a excessiva de células T respostas. Nos últimos anos, os anticorpos anti-PD-1 têm sido implicados no tratamento de várias neoplasias malignas1,2. PD-1 ligadura restringe várias funções de células T, incluindo a proliferação, adesão e secreção de várias citocinas3,4,5. PD-1 está localizada a sinapse imunológica, a interface entre as células T e apresentadoras células6, onde ele colocalizes com os receptores de células T (TCR)7. Posteriormente, a tirosina fosfatase SHP2 [Src homologia 2 (SH2) domínio contendo tirosina fosfatase 2] é recrutado para a cauda citoplasmática da PD-1, levando a dephosphorylation de resíduos tirosina chave dentro complexo TCR e seu associado proximais sinalização moléculas3,4,5,8,9. A cauda citoplasmática da PD-1 contém dois motivos de tirosina, um immunoreceptor baseada em tirosina inibitório do motivo (ITIM) e um immunoreceptor tirosina motivo baseado-switch (ITSM)10. Ambos os motivos são fosforilados sobre PD-1 ligadura9,10. Mutagênese estudos têm revelado um papel primordial para o ITSM no recrutamento, em oposição a ITIM, cujo papel na função e PD-1 sinalização não é claro. SHP24.
SHP2 adota qualquer um fechado (dobrado), inibiu a conformação ou aberto (estendido), conformação ativa11. A contribuição de cada domínio de cauda do PD-1 SHP2 vinculação ou ativação ainda não foi elucidada. Para responder a esta pergunta, nós desenvolvemos um ensaio que permite testar paralelo do recrutamento de SHP2 à cauda da PD-1 e sua atividade12. Utilizamos o co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade de fosfatase em grânulo para testar a interação e a atividade enzimática em paralelo. Usando este ensaio, mostramos que o ITSM de PD-1 é suficiente para recrutar SHP2 à cauda da PD-1, enquanto o ITIM de PD-1 é necessária para totalmente estender e ativar a enzima.
Existem muitos receptores que possuem vários domínios adjacentes em sua cauda citoplasmática. O ensaio funcional co-imunoprecipitação pode descobrir o papel de domínios específicos que são necessárias para o recrutamento de proteína ou ativação enzimática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Receptor-enzima interações são cruciais para sinalização intracelular. Muitas enzimas são recrutadas aos receptores através de domínios SH2 vinculando a tyrosines fosforiladas que decoram as caudas dos mesmos receptores. No entanto, enzimas são muitas vezes dobradas em conformações inativas fechadas e ativação requer uma mudança conformacional11 que pode ser mediada por outros domínios do mesmo receptor. O ensaio descrito aqui medidas as interações entre receptores e enzimas, bem …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi financiado pelo NIH bolsas 1R01AI125640-01 e a Fundação de pesquisa de Reumatologia.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
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