Ensayo de co-inmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre los receptores y enzimas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de co-inmunoprecipitación y un ensayo de actividad enzimática en el grano al mismo tiempo estudiar la contribución de los dominios de la proteína específica de los receptores de la membrana plasmática para reclutamiento de la enzima y la actividad enzimática.
Abstract
Asociado a receptor de enzimas son los principales mediadores de la activación celular. Estas enzimas son reguladas, al menos en parte, por interacciones físicas con la cola citoplasmática de los receptores. Las interacciones a menudo se producen a través de dominios específicos de la proteína y resultan en la activación de las enzimas. Existen varios métodos para estudiar interacciones entre proteínas. Co-inmunoprecipitación se utiliza habitualmente para estudiar los dominios que se requieren para las interacciones proteína-proteína, hay no hay ensayos documento la contribución de los dominios específicos a la actividad de las enzimas reclutadas al mismo tiempo. Por consiguiente, el método descrito aquí combina co-inmunoprecipitación y un análisis de la actividad enzimática en el grano para la evaluación simultánea de las interacciones entre las proteínas y la activación enzimática asociada. El objetivo de este protocolo es identificar los dominios que son esenciales para las interacciones físicas entre una proteína y enzima y los dominios que son obligatorios para la completa activación de la enzima. Se demuestra la importancia de este ensayo, como cierto receptor dominios proteicos contribuyen a la Unión de la enzima a la cola citoplasmática del receptor, mientras que otros dominios son necesarias para regular la función de la misma enzima.
Introduction
Receptores catalíticos y cinasas de tirosina de receptores son proteínas transmembranales en la que la Unión de un ligando extracelular provoca actividad enzimática en el lado intracelular1. Algunos receptores poseen receptores y funciones enzimáticas, mientras que otros reclutan las enzimas específicas como las quinasas y fosfatasas que sus colas citoplásmicas. Contratación de una enzima a la cola del receptor y la acción catalítica de esta enzima son dos procesos separados que no siempre están regulados por la misma proteína dominios2. Por desgracia, hay no hay herramientas específicas para evaluar la interacción y la actividad enzimática al mismo tiempo. El ensayo funcional co-inmunoprecipitación se describe aquí es un método útil para disecar la contratación de una enzima a la cola de un receptor de su activación. Este ensayo utiliza inmunoprecipitación de receptores etiquetados granos recubiertos de anticuerpos. Posteriormente, un ensayo de actividad enzimática y la mancha blanca /negra occidental análisis en granos se llevan a cabo. El objetivo general de este método es descubrir qué dominios de proteína son necesarios para las interacciones entre los receptores y enzimas (determinadas por análisis de western blot) y qué dominios son obligatorios para la completa activación de las enzimas (medido por el cordón ensayo de actividad enzimática). Es importante desarrollar herramientas para el estudio de las funciones separadas de enzimas asociado a receptor debido a su participación en la patogenia de enfermedades humanas. Por otra parte, la mayor comprensión de los mecanismos de acción de estas proteínas puede ayudar el diseño de nuevas intervenciones terapéuticas.
Muerte programada-1 (PD-1) es un receptor inhibitorio en la superficie de las células de T y es necesaria para limitar el excesivo T cell responses. En los últimos años, se han implicado anticuerpos anti-PD-1 en el tratamiento de múltiples tumores malignos1,2. PD-1 ligadura refrena numerosas funciones de la célula de T, incluyendo la proliferación, adhesión y secreción de varias citoquinas3,4,5. PD-1 se localiza en la sinapsis inmunológica, la interfaz entre las células T y células presentadoras de antígeno6, donde colocalizes con el receptor de células T (TCR)7. Posteriormente, la tirosina fosfatasa SHP2 [homología Src 2 (SH2) dominio que contiene tirosina fosfatasa 2] es reclutado a la cola citoplasmática de PD-1, conduce a la desfosforilación de residuos claves de tirosina dentro el complejo TCR y su asociado proximal señalización de moléculas3,4,5,8,9. La cola citoplasmática de PD-1 contiene dos motivos de tirosina, un immunoreceptor basados en tirosina inhibidor adorno (ITIM) y un immunoreceptor tyrosine interruptor basado en motif (ITSM)10. Ambos motivos son fosforiladas en PD-1 ligadura9,10. Estudios de mutagénesis han revelado un papel primordial para el ITSM en el reclutamiento, a diferencia de ITIM, cuyo papel en la señalización de PD-1 y la función no está clara de SHP24.
SHP2 adopta sea un cerrado (doblado), inhibió la conformación o abierto (extendido), conformación activa11. La contribución de cada dominio de la cola de PD-1 SHP2 vinculante o activación aún no se ha aclarado. Para responder a esta pregunta, hemos desarrollado un análisis que permite la prueba paralela del reclutamiento de SHP2 a la cola de PD-1 y su actividad12. Emplean co-inmunoprecipitación y un análisis de la actividad de fosfatasa en grano para probar la interacción y la actividad enzimática en paralelo. Usando este análisis, nos muestran que el ITSM de PD-1 es suficiente para reclutar SHP2 a la cola de PD-1, mientras que el ITIM de PD-1 se necesita ampliar y activar la enzima.
Existen muchos receptores que tienen varios dominios adyacentes en su cola citoplasmática. El análisis funcional co-inmunoprecipitación puede descubrir el papel de los dominios específicos que son necesarios para el reclutamiento de la proteína o la activación enzimática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Interacciones receptor-enzima están cruciales para la señalización intracelular. Muchas enzimas son reclutadas a los receptores a través de dominios SH2 a tirosinas fosforiladas que decoran las colas de los mismos receptores. Sin embargo, enzimas se doblan a menudo en conformaciones inactivos cerrados, y la activación requiere un cambio conformacional11 que puede estar mediado por otros dominios del receptor del mismo. El ensayo descrito aquí medidas de las interacciones entre receptores y e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH 1R01AI125640-01 y la Fundación de investigación de reumatología.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
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