Macropinocytosis, store uspecifikke væske optagelse, er vigtige i mange områder af klinisk biologi herunder immunologi, infektion, kræft og neurodegenerative sygdomme. Her, er eksisterende teknikker blevet tilpasset til at give høj overførselshastighed, encellede opløsning måling af macropinocytosis i macropinocytosis model organisme Dictyostelium discoideum benytter flow flowcytometri.
Store ikke-specifikke væske optagelsen af macropinocytosis er vigtig for spredningen af visse kræftceller, antigen prøveudtagning, vært celle invasion og spredning af neurodegenerative sygdomme. De almindeligt anvendte laboratorium stammer af amoeba Dictyostelium discoideum har ekstremt høje væske optagelse priser når der dyrkes i næringsstof medium, over 90% der er på grund af macropinocytosis. Derudover findes mange af de kendte kernekomponenter af pattedyr macropinocytosis også, hvilket gør det en fremragende modelsystem for at studere macropinocytosis. Her, er den standard teknik til at måle internaliseret væske ved hjælp af fluorescerende dextran som en etiket, der tilpasset en 96-brønd plade format, med prøverne analyseres ved flowcytometri ved hjælp af en høj overførselshastighed prøveudtagning (HTS) vedhæftet fil.
Celler er fodret ikke-quenchable fluorescerende dextran for et forud fastsat tidsrum, vaskes ved nedsænkning i iskold buffer og adskilt ved hjælp af 5 mM natriumazid, som også stopper exocytose. Celler i hver brønd er derefter analyseret ved flowcytometri. Metoden kan også tilpasses måle membran optagelse og fagocytose af fluorescerende perler eller bakterier.
Denne metode var designet til at tillade måling af væske optagelse af Dictyostelium i en høj overførselshastighed, arbejdskraft og ressource effektivt. Det giver mulighed for samtidige sammenligning af flere stammer (f.eks knockout mutanter af et gen) og betingelser (fx celler i forskellige medier eller behandlet med forskellige koncentrationer af inhibitor) parallelt og forenkler tid-kurser.
Store ikke-specifikke væske optagelsen af macropinocytosis er vigtige i flere biologiske sammenhænge1, herunder antigen prøveudtagning af immun celler2, patogen ibrugtagning vært celler3, kræft celle spredning4 og den spredning af prion sygdomme5. I pattedyr og Dictyostelium celler, actin6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (selv om den nøjagtige karakter af lipid adskiller sig mellem de to11), aktiveret RAS12,13, og aktiveret Rac14,15 er vigtige for effektiv væske optagelsen af macropinocytosis, selv om der stadig er mange ubesvarede spørgsmål om, hvordan macropinocytic patch er dannet, organiseret og i sidste ende internaliseret. At opdage mere protein vigtige for macropinocytosis, og efterfølgende bestemmelse af hvordan de er vigtige i de forskellige biologiske sammenhænge, vil give en mere omfattende forståelse af macropinocytosis og potentielt giver mulighed for udvikling af målrettede behandlinger for en række betingelser.
Dictyostelium er en ideel modelsystem for at studere macropinocytosis. Det høje niveau af konstituerende macropinocytosis i standard laboratorium stammer betyder, at væske optagelsen er over 90% på grund af macropinocytosis6. Dette giver mulighed for macropinocytosis skal måles alene ved at bestemme væske optagelse, i modsætning til pattedyrceller, hvor andelen af flydende udbredelse på grund af macropinocytosis er meget lavere. At macropinocytosis er så veldefineret og let visualiseret12 i dette system ligeledes tilbyder forskellige fordele for at undersøge kerne bevarede komponenter af macropinosome over andre systemer hvor der kan være flere regulerende signaler 16 , 17.
Standard teknik, der anvendes til at måle macropinocytosis af pattedyrceller indebærer fastsættelse af celler efter pulserende med dextran for en kort periode efterfulgt af mikroskopi til at bestemme området af en celle, der er besat af dextran-positive vesikler18. Denne teknik tager dog ikke højde for muligheden for macropinosomes faldende ved ankomsten til den celle, der er blevet rapporteret i Dictyostelium19, og kun tager hensyn til enkelt fly af den celle, hvilket betyder den mængde internaliseret er uklart. En alternativ teknik, tælle antallet af macropinosomes internaliseret i en given tid, har den samme ulemper20. Ved hjælp af Dictyostelium undgår disse problemer; eksisterende teknikker til at måle væske optagelsen af Dictyostelium er dog relativt arbejdsintensive, ved hjælp af en stor mængde af både celler og dextran21. Celler er rystet på høj tæthed i fluorescerende dextran og prøver fjernet på forskellige tidspunkter for bestemmelse af den internaliseret fluorescens ved hjælp af en fluorimeter. Celler tilberedt på denne måde kan analyseres ved flowcytometri at få enkelt celle, i stedet for befolkningsniveau, opløsning22, selv om dette stadig lav-overførselshastighed.
Her, er den standard teknik til at måle internaliseret væske ved hjælp af fluorescerende dextran som en etiket, der tilpasset en 96-brønd plade format, med prøverne analyseres ved flowcytometri ved hjælp af en høj overførselshastighed prøveudtagning (HTS) vedhæftet fil. Celler er fodret ikke-quenchable fluorescerende dextran for et forud fastsat tidsrum, vaskes ved nedsænkning i iskold buffer og adskilt ved hjælp af 5 mM natriumazid, som også stopper exocytose. Celler i hver brønd er derefter analyseret ved flowcytometri. Denne metode var designet til at overvinde begrænsningerne af de ovenfor nævnte metoder og tillade samtidige sammenligning af væske optagelsen af et stort antal stammer/betingelser samtidig ved hjælp af færre ressourcer og reducere arbejdskraft involveret.
Andre metoder til at vurdere væske optagelse er lav dataoverførselshastighed, vaske cellerne i situ og brugen af natriumazid Adskil celler er de kritiske trin i denne metode, som tillader høj overførselshastighed måling af macropinocytosis, membran optagelsen, eller fagocytose af Dictyostelium. Som cellerne er knyttet til en overflade og mediet er ikke, kan de venstre knyttet mens medium omkring dem er først smidt ud og derefter ændret ved nedsænkning i buffer og smidt ud igen. Natriumazid, som dræner cellulære ATP og depolarizes membran30, bruges derefter til at frigøre cellerne, og forhindrer også exocytose uden at påvirke celle levedygtighed24.
Mens bruger flowcytometri til at måle macropinocytosis af Dictyostelium giver en meget nøjagtig måling af væske optagelse meget hurtigt for at fastslå grunden til hvorfor en bestemt stamme eller betingelse har ændret væske optagelse, yderligere undersøgelse ved hjælp af mikroskopi er påkrævet24. Det skal også bemærkes at tidligere offentliggjorte resultater har, i nogle tilfælde vist en forskel i væske optagelse af mutantstammen dyrkes enten på en overflade (som i dette tilfælde), eller i ryster suspension (som i standard-protokol)31. Ved hjælp af denne metode kan betyde, at, i sjældne tilfælde, tilsyneladende flydende optagelse defekter er savnet. Derudover når du måler fagocytose, kan kun lave koncentrationer af partikler bruges. Den maksimale sats for fagocytose, som kan bestemmes med denne teknik er langt under det virkelige maksimum, selvom det er stadig muligt at måle relevante forskelle i fagocytose mellem stammer og betingelser24. For at bestemme den maksimale sats for fagocytose, skal optagelsen måles i ryster suspension af en alternativ protokollen27. Celler, der har phagocytosed perler steget side scatter, så dette bør være korrigeret for tilsvarende når du konfigurerer flow forskellige.
Flowcytometri kan bruges til at måle væske optagelse i pattedyrceller32, men den højere andel af væske fase optagelsen af andre endocytic veje, end set i Dictyostelium er en bekymring. Derudover er celler typisk adskilles ved hjælp af trypsin ved 37 ° C, så yderligere endocytic progression af internaliseret dextran. Iskold natriumazid forårsager ikke makrofager at løsne sig fra en overflade (Williams, upubliceret observation), hvilket gør denne teknik ikke finder anvendelse på pattedyrceller uden yderligere optimering.
Høj overførselshastighed måling af macropinocytosis har potentiale til at blive anvendt til at screene hurtigt og billigt for virkningerne af hæmmere, genetiske mutation eller gen knockdown på Dictyostelium celler. Mutanter bør altid være i forhold til deres direkte overordnet kun. Hvis læseren har ingen forudgående præference for Dictyostelium stamme, ikke-axenic stammer som DdB eller NC4 er mere “wild-type” end axenic og kan manipuleres så effektivt som axenic stammer33. Ellers Ax2 stammer er de axenic stammer med de færreste genom gengangere34, mens mange stammer af Ax4 Talin A knockouts og bør undgås om muligt23. De fleste tidligere udgivne stammer kan bestilles fra Dicty Stock Center35.
Denne teknik giver mulighed for større efterforskningsmæssige muligheder end det var tidligere muligt i virkningerne af forskellige betingelser, hæmmere og mutationer på macropinocytosis af Dictyostelium.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de medicinske Forskningsråd UK for core finansiering (U105115237) til RRK.
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |