マクロピノサイトーシス、大規模な非固有の流体吸収、免疫、感染症、がん、神経変性疾患を含む臨床生物学の多くの分野で重要です。ここでは、既存の手法はマクロピノサイトーシス モデル生物キイロタマホコリカビ使用マクロピノサイトーシスの計測フローサイトメトリー高スループット、単一セルの解像度を許可するように適応されています。
大規模な非特異的流体吸収マクロピノサイトーシスは特定の癌細胞、抗原サンプリング、ホスト細胞浸潤、神経変性疾患の広がりの増殖にとって重要です。アメーバ細胞性粘菌キイロタマホコリカビの一般的に使用される実験室の緊張は、マクロピノサイトーシスが 90% の以上の培養液で栽培された流体吸収が非常に高いレートを持っています。また、マクロピノサイトーシスを勉強するためのエクセレント モデル システムは現在、哺乳類マクロピノサイトーシスの既知のコア コンポーネントの多く、また。ここでは、ラベルとして蛍光デキストランを用いた内面流体を測定する標準的な方法は、高速サンプリング (HTS) 添付ファイルを使用して、フローサイトメトリーで分析したサンプル 96-well 版のフォーマットに適応です。
細胞は、あらかじめ決められた時間、浸漬冷たいバッファーで洗浄、5 mM のアジ化ナトリウムがまた分泌を停止するを使用して戸建のため非水魔蛍光デキストランを供給されています。各ウェル内のセルは、フローサイトメトリーで分析しています。メソッドは、膜吸収および蛍光ビーズや細菌の貪食能を測定に適応できます。
このメソッドは、高スループット、労働およびリソース効率的に細胞性粘菌によって流体吸収の測定を許可するように設計されました。複数の菌株 (例えば遺伝子のノックアウト変異) と条件の同時比較が可能に (例えば細胞のさまざまなメディアで、阻害剤の濃度の異なる扱われます) 並行し時間コースを簡素化します。
大規模な非特異的流体吸収マクロピノサイトーシスはいくつか生物学的コンテキスト1に重要な細胞によって免疫抗原サンプリングを含む2、病原体参入ホスト細胞3、癌細胞増殖4とプリオン病5の広がり。哺乳類、細胞性粘菌アクチン6、7、π (3,4,5) P38,9,10 (脂質の正確な性質が異なる 2 つの11の間) が、活性化Macropinocytic パッチの方法について多くの疑問が残っているが Ras12,13, と活性 Rac14,15がマクロピノサイトーシス、効率的な流体吸収のために重要組織化され、最終的には内面、形作られます。マクロピノサイトーシスとどのように彼らが様々 な生物学的文脈で重要のそれに続く決定の重要な多くのタンパク質を発見マクロピノサイトーシスのより包括的な理解を与える、悪意のあるの開発条件の範囲のための治療を対象とします。
細胞性粘菌は、マクロピノサイトーシスを研究するための理想的なモデル システムです。標準的な実験室の緊張の構成マクロピノサイトーシスの高レベルは、その流体吸収はマクロピノサイトーシス6により 90% を意味します。これはマクロピノサイトーシス マクロピノサイトーシスによる流体吸収の割合ははるかに低い哺乳類細胞とは異なり、流体の吸収を決定するだけで測定することができます。マクロピノサイトーシスはとてもよく定義されて、このシステムで簡単に可視化12を同様に提供を調査するための明確な利点は他のシステム上、macropinosome の保存されているコンポーネントをコア複数の規制信号があります。16,17。
18デキストラン陽性膜小胞で占められているセルの領域を決定する顕微鏡に続いて短期間のデキストランをパルス後固定セル マクロピノサイトーシスを測定する哺乳類細胞で使用される標準的な方法が含まれます。この手法はしかし macropinosomes だけ内面化ボリュームを意味セルの単一の平面を考慮し、細胞性粘菌19で報告されている細胞に入ると縮小の可能性を考慮しません不明です。Macropinosomes 与えられた時間内在化している数を数える、代替手法が同じマイナス20。細胞性粘菌を使用すると、これらの問題が回避できます。しかし、細胞性粘菌液吸収を測定するための既存の技術が比較的細胞およびデキストラン21の労働集約的な大規模な使用量です。細胞蛍光デキストランと、蛍光を使用して内面化された蛍光性の定量のための様々 な時点で削除のサンプル高密度で揺さぶられます。このまま低スループットが、解像度の22、人口レベルではなく、1 つのセルを得るためにフローサイトメトリーによる細胞はこのように調製を分析できます。
ここでは、ラベルとして蛍光デキストランを用いた内面流体を測定する標準的な方法は、高速サンプリング (HTS) 添付ファイルを使用して、フローサイトメトリーで分析したサンプル 96-well 版のフォーマットに適応です。細胞は、あらかじめ決められた時間、浸漬冷たいバッファーで洗浄、5 mM のアジ化ナトリウムがまた分泌を停止するを使用して戸建のため非水魔蛍光デキストランを供給されています。各ウェル内のセルは、フローサイトメトリーで分析しています。このメソッドより少ないリソースを使用して労力を軽減し、ながら系統/条件の多数の流体の摂取量の同時比較ができ、上記の方法の限界を克服するために設計されました。
流体の摂取量を評価するために他の方法は低スループットである一方マクロピノサイトーシス、膜吸収の高スループット測定をできるように、このメソッドで重要な手順は、その場で細胞と細胞をデタッチするアジ化ナトリウムの使用を洗浄または貪食細胞性粘菌。細胞が表面に付着し、媒体ではない、彼ら左周り中が最初に投げ時に取り付け、その浸漬バッファーを変更でき再びオフにスローされます。細胞の ATP の枯渇と30の膜を脱分極、アジ化ナトリウムを使用して、セルをデタッチし、も24セル実行可能性に影響を与えずに開口放出を防ぎます。
特定の株または条件が流体の摂取量を変更する理由理由を確立する非常に迅速に、流体吸収の非常に正確な測定を与えるフローサイトメトリーを使用して細胞性粘菌によってマクロピノサイトーシスを測定するそれ以上の調査を使用して顕微鏡は必要な24です。それも注意しなければならないこと以前に発行された結果、いくつかのケースで違いを示している流体吸収で突然変異系統のいずれか (この場合は) のように表面上に成長または懸濁液 (標準プロトコル) のように31の揺れ。このメソッドを使用して、まれに、明らかな流体吸収不良を逃している可能性があります。また、貪食能を測定するとき、粒子の低濃度が使用できます。菌株と条件24の貪食の関連の違いを測定することも可能だが、この手法で決定することができます食の最大レートは本当の最大値をはるかに下回るです。食の最大レートを決定するには、吸収は、代替プロトコル27によって懸濁液を振動で測定しなければなりません。この訂正されるべきのそれに応じて流れの cytometer を設定するとき、ビーズを貪食した細胞は側方散乱を増加しています。
フローサイトメトリーを使用して哺乳類セル32の流体の摂取量を測定できます、流体のより高い割合で他のエンドサイトーシス経路による吸収を相ただし細胞性粘菌に見られるよりも、心配です。また、セルは通常 37 ° c、さらに内面のデキストランのエンドサイトーシスの進行を許可するトリプシンを使用して戸建します。冷たいアジでは、この手法をさらに最適化を行う哺乳類セルには適用されません、サーフェス (ウィリアムズ、未発表観測) からデタッチするマクロファージは発生しません。
マクロピノサイトーシスの高スループット測定画面のすぐにそして安く細胞性粘菌に及ぼす阻害剤、遺伝子の突然変異や遺伝子の打撃に使用する可能性があります。変異体は、彼らの直接の親のみを常に比較必要があります。読者には、細胞性粘菌のひずみの事前設定がなければ、DdB や NC4 など非無菌系統は無菌のものよりも「野生型」より、し、、無菌系統33として効果的に操作することができます。そうでなければ、ax2 横型の系統は、無菌系統が最も少ないゲノム重複34Ax4 の多くの菌株タリン A ノックアウトする必要があります回避可能であれば23。最も以前に発行された系統は、35Dicty ストック センターから注文できます。
このテクニックには、さまざまな条件、阻害剤、細胞性粘菌によってマクロピノサイトーシスの突然変異の効果に以前可能だったより大きい調査の可能性ができます。
The authors have nothing to disclose.
コア RRK (U105115237) の資金の医学研究議会イギリスに感謝いたします。
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |