反向转录-环介导的等温放大 (RT 灯) 测定尿液、血清和蚊子标本中的 Zika 病毒和管家基因
Summary
该协议提供了一种高效、低成本的方法, 用于检测人体尿液、血清样品或蚊子中的 Zika 病毒或控制靶, 采用反向转录环介导的等温放大 (RT 灯)。此方法不需要 RNA 隔离, 可以在30分钟内完成。
Abstract
感染 Zika 病毒 (ZIKV) 可能是无症状的成人, 但是, 在怀孕期间感染可能导致流产和严重的神经系统出生缺陷。该协议的目标是快速检测人类和蚊子样本中的 ZIKV。目前 ZIKV 检测的金标准是定量反向转录 pcr (qRT pcr);反向转录回路介导的等温放大 (RT 灯) 可能允许更有效和低成本的测试, 而不需要昂贵的设备。在本研究中, RT 灯用于在30分钟内在各种生物样品中 ZIKV 检测, 而不首先从样品中分离出 RNA。这种技术是使用 ZIKV 感染的病人尿液和血清, 以及感染的蚊子样本。18S. 核糖体核糖核酸和肌动蛋白分别用作人体和蚊子标本的对照。
Introduction
在 2015年, Zika 病毒 (ZIKV) 作为一种传染性疾病引起了全球瞩目, 因为怀孕期间的感染与流产、死胎、严重的神经系统先天缺陷 (包括小头) 以及其他先天性出生缺陷1。在极少数情况下, ZIKV 与格林-巴利综合征有关。ZIKV 主要由白纹蚊传播;然而, 它也可以通过性接触传播1。鉴于感染 ZIKV 的人在多数人中无症状, 或出现轻度流感样症状, 与其他 arborviruses1感染的症状重叠, 因此需要改进方法, 快速和经济高效地检测ZIKV, 以筛查人和当地蚊子的数量。
定量反向转录 pcr (qRT pcr) 是一种可靠的 ZIKV 检测方法;然而, 这种技术需要昂贵的专业设备, 训练有素的人员, 和 RNA 分离从样本的兴趣。反向转录回路介导的等温放大 (RT 灯) 是一种基于 PCR 技术的一步核酸扩增方法, 它只需要一个孵化温度由于使用了嗜热 DNA 聚合酶与链位移特性。这就绕过了对 thermocycler 的需要, 减少了完成化验所需的时间长短。RT 灯的其他优点包括其高度特异性和灵敏度, 在 pH 水平和温度范围内的鲁棒性, 以及对许多 PCR 抑制剂2的抗性。它的成本相对较低, 试剂在室温下稳定。鉴于这些特点, RT 灯可以部署在实验室或现场。因此, 已经开发了灯反应, 以检测一系列的病原体和其他类型的感染3,4,5。本文所描述的 RT 灯协议的目标是检测在人体血清和尿样中没有 RNA 分离的 ZIKV, 以及通过 RT 灯在30分钟以内的单一感染蚊子。该方法可用于替代 qRT PCR, 因为它是一种灵敏的, 快速的诊断工具, 工作迅速和在实验室以外的设置。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文所描述的 ZIKV RT 灯的研究工作使用的人和蚊子样本6。检测的限制约为1基因组等效6, 这应该是足够的, 因为典型的病毒负荷的症状 ZIKV 感染患者是 10 3 至 106 PFU/毫升7。此外, 该方法可以检测不先分离 RNA 的样品中的 ZIKV, 细胞培养中不存在病毒放大。与 qRT PCR 相比, 这大大降低了这种检测的时间、成本和健康风险。</p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了莫林和罗纳德-神经家庭慈善捐款和密歇根州圣玛丽的实地研究所的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。我们还感谢伯纳黛特 Zwaans 博士和以利亚沃德对手稿的批判性审查。
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
