Her presenterer vi en protokoll forberedelse til agarose-fylt menneskelige presisjonsstyrte kutte lunge skiver fra resected pasienten vev som er egnet for å generere 3D lunge vev kulturene modell menneskelige lungesykdommer i biologiske og biomedisinsk studier.
Oversettelse av romanen funn som menneskelig sykdom er begrenset av tilgjengeligheten av menneskelig vev-baserte modeller av sykdom. Presisjonsstyrte kutte lunge skiver (PCLS) brukes som 3D lunge vev kulturer (3D-LTCs) representerer en elegant og biologisk svært relevante 3D celle kultur modell, som ligner svært på i situ vev på grunn av sin kompleksitet, biomekanikk og molekylære komposisjon. Vev kutting er mye brukt i ulike dyr modeller. 3D-LTCs avledet fra menneskelige PCLS kan brukes til å analysere Svar å romanen narkotika, som kan videre hjelpe deg å bedre forstå de mekanismer og funksjonelle effekten av legemidler i menneskelig vev. Utarbeidelse av PCLS fra kirurgisk resected lunge vevsprøver av pasienter, som erfarne lunge lobectomy, øker tilgjengeligheten av syke og peritumoral vev. Her beskriver vi en detaljert protokoll for generering av menneskelig PCLS fra kirurgisk resected myk-elastisk pasientens lungevev. Agarose ble introdusert i bronchoalveolar løpet av resectates, dermed bevare lunge strukturen og øke vevets stivhet, som er avgjørende for påfølgende kutting. 500 µm tykke skiver var forberedt fra vev blokken med en vibratome. Biopsi slag fra PCLS sikre sammenlignbare vev utvalgene og øke mengden av vevsprøver. Genererte lunge vev kulturer kan brukes i en rekke studier i menneskelig lunge biologi, inkludert patofysiologi og mekanismer av ulike sykdommer, for eksempel fibrotiske prosesser på sitt beste på (sub-) mobilnettet nivå. Høyeste fordelen av 3D-LTC ex vivo modellen er nær representasjonen av i situ menneskelige lunge i 3D vev arkitektur, celle type mangfold og lunge anatomi samt potensialet for vurdering av individuelle pasienter, som er relevant å videreutvikle romanen strategier for presisjon medisin.
Kronisk og akutt lungesykdommer er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet verden1. For pasienter med kroniske lungesykdommer som hindrende lunge sykdom (COPD)2, alvorlig astma3, lunge kreft4 og diffuse parenchymal lunge sykdommer5er helbredende terapier ikke tilgjengelig. Selv om studier i dyremodeller for lungesykdommer har dypere forståelse av sykdommen pathomechanisms6 og har ført til identifisering av potensielle romanen terapeutiske mål7,8,9, disse modellene viser relevante biologiske og fysiologiske forskjeller sammenlignet med mennesker10. For å overvinne disse avvikene mellom murine og menneskets biologi samt anatomi, menneskelige ex vivo 3D lunge vev kultur er (3D-LTC) systemer brukt i ulike områder av biomedisinsk forskning. Disse 3D-LTC kultur systemene er basert på presisjonsstyrte kutte lunge skiver (PCLS). Generasjonen av PCLS ex vivo tillater analyse av en tredje romlige dimensionality, som gir mulighet for etterforskningen av romlige og funksjonelle forholdet mellom celler i hele alveoler og airways11, samt interstitium, blodkar og mesothelium. Spesielt er PCLS ex vivo modeller flercellet, betyr at de inneholder mest funksjonelle cellene i i situ lungene, dermed tett som representerer cellene innfødt biologiske miljøet og dermed overvinne den begrenset celle-celle og celle-matrix samhandling i de fleste 2D cellekultur tilnærminger. Inntil nå, ex vivo murine PCLS ble brukt til å modellere lunge sykdommer som COPD12, lunge fibrosis13, lunge kreft14, virusinfeksjon15,16, bronkopulmonal dysplasia17, og astma18. Imidlertid en betydelig andel av roman stoff terapi i menneskelig lungesykdommer som ble undersøkt i kliniske forsøk ikke oversette til klinikken på grunn av deres mangel på effekt eller sikkerhet, assumingly grunn ennå betydelig forskjeller mellom menneske og murine biologi og sykdom19,20,21.
Over flere år, har menneskelige PCLS vært i stor grad brukt å vurdere lunge toksisitet av kjemikalier og narkotika. Bare nylig har menneskelige lungevev vært brukt fra pasienter med COPD22,23, astma24og lunge fibrosis25, å forfølge patofysiologiske og farmakologiske studier. Bruke resected pasienten orgel materiale og generere PCLS, en kan recapitulate store sykdom kjennetegnene i en kompleks 3D vev miljø22 representerer og vedlikeholde mesteparten av innfødte mobilnettet mangfoldet av orgelet. Videre ble syke vev som er brukt i en rekke eksperimentelle oppsett vist å etterligne sykdom som endringer i lever, tarm og nyre26,27,28,29.
Behandling av lungevev imidlertid utfordrende av flere grunner. I motsetning til solid vev, innfødt lunge parenchyma tendens til å skjule uten ventilasjon og utstillinger lavere vev stivhet. Disse egenskapene hindre kutting av vev. Dermed fylling av luftveiene og alveolar plass med lav-smeltende punkt agarose bevarer den opprinnelige lunge strukturen og gir stivhet nødvendig for presisjonsstyrte kutte kutting av murine og menneskelig lungene30. Menneskelige lunge resectates donert til forskningsformål er i sin natur anatomisk, genetisk og fysiologisk svært variert, dermed ofte presentere en høy Inter pasienten variasjon når utføre eksperimenter25. I motsetning til hele lobe eller hele lunge explants, lunge prøver resected med thorax kirurgi ikke nødvendigvis følger anatomiske segmentene og, derfor krever spesielle forberedelser. I denne artikkelen gir vi en detaljert og optimalisert protokoll for generering av menneskelig PCLS fra resected lungevev og påfølgende dyrking og rekreasjonsbruk til modell lungesykdom.
Protokollen beskrevet i dette manuskriptet dekker generasjonen av PCLS fra menneskelige lunge vev resectates ved å fylle den med flytende agarose og senere vibratome slicing. Generasjon av vev skiver var vist før et par organer, som lever og hjernen, mens iboende stivhet av disse organene tillatt direkte kutting uten endringer av vev. Av notatet er den første riktige forberedelsen av lungevev det mest avgjørende skrittet i å generere PCLS. Agarose fylling av lunge er metoden for valg å stabilisere sin myke og elastiske natur, og å sikre en homogen og reproduserbar PCLS generasjon. Store luftveiene resected lungevev er cannulated for å gi tilgang til små luftveiene og intakt lunge parenchyma. Mangel på en intakt pleura, som gjør agarose fylle nesten umulig, er en viktig grunn til hvorfor lungevev er stort sett ikke anvendelig for lunge kutting. Prospektivt, kan en syntetisk pleura opprinnelig utviklet for å utføre funksjonelle eksperimenter på decellularized stillaser potensielt brukes for å oppnå vellykket agarose fylling av explants som mangler en intakt pleura31. Resections resulterer i en menneskelig lunge vev stykke med intakt pleura er avgjørende for å generere vev blokker til kutting. Kappet vev er mer tilgjengelig på grunn av svulsten uten vev fra kreft resections enn fullt intakt lobes eller hele-lung explants av pasienter som gjennomgikk lungetransplantasjon.
Vanligvis to systemer brukes til å produsere PCLS: Krumdieck vev slicer15 og vibrerende mikrotomer (vibratomes). Vev slicere generere skiver av passerer en vev-blokk gjennom et metall fartøy, som skjærer PCLS ved 90° på slutten av fartøyet. Vibratomes genererer PCLS ved å flytte en vibrerende kniv vannrett over en forankret blokk av vev som er neddykket i en avkjølt middels bad, som sammenlignet med Krumdieck sliceren utøver mindre skjær makt på vevet. Dette resulterer i mindre hard behandling av vevet før dyrking. På den annen side, er vibratome kutte mer tid og arbeid forbruker. I våre hender, vibratome kutting aktivert produksjonen av maksimalt 100 PCLS eller 500 PCLS slag på en dag, tilstrekkelig for mest eksperimentelle studier. PCLS kan kultivert på ulike måter: (a) knyttet til Trans-brønner, dermed generere et flytende air-grensesnitt (ALI) system, (b) som dynamisk orgel kultur (DOC), eller (c) neddykket i celle kultur medium på standard celle kultur forhold. I detalj dyrking av PCLS ble beskrevet tidligere22,23,25; en felles standard av dyrking forhold mellom deres bruk i ulike labs verden er imidlertid fremdeles mangler. Spesielt kultur tiden kan være kritisk: som murine PCLS, tap av SFTPC positive alveolar type 2 celler er observert etter 144 h, men ikke etter 120 h22. I tillegg synes metabolsk aktivitet å være stabil i murine22 og menneskelig PCLS25 for 120 timer.
Det er et par av tekniske begrensninger for generering av PCLS: antall og størrelsen på resectates varierer over tid; effektiviteten av agarose fyller, som avhenger av tilstedeværelsen av intakt pleura i innhentet vevet, bestemmer den endelige suksessen av PCLS generasjon; og vev skyldes patologiske forandringer i innhentet (syke) lungevev kan forstyrre PCLS utarbeidelse. Airway hindringer og fibrotiske vev mangler intakt alveolar plass hindre med agarose fylle og dermed gjøre slicing av fibrotiske vev en krevende oppgave. Emphysematous vev som finnes i sykdommer som COPD eller alfa-1-anti-trypsin mangel ikke kan motstå presset av agarose fylle, og vil medføre brudd alveoler og arkitektoniske gjenstander. I disse tilfellene, kan bruk av lav agarose konsentrasjon, f.eks, 1% (w/v), være nyttig til å redusere trykket og hastighet under agarose fylling. Samlet kan sykdom delstaten vevet dramatisk begrense bruken av vev for PCLS generasjon. Alle disse parametrene bestemme mengden av PCLS som kan genereres fra lungevev, og også hvor lang tid det tar for å produsere PCLS. Ytterligere er begrensninger i PCLS uoverensstemmelser mellom ulike lunge skiver med hensyn til størrelse eller vev innhold, som krever ytterligere normalisering trinnene for eksperimenter. For å overvinne dette, kan biopsi slag av lignende regioner i samme stykke genereres. Denne fremgangsmåten er tilbøyelig til å redusere vev variasjon, og som en ekstra fordel, øke antall PCLS utdrag som kan brukes i eksperimenter.
Avslutningsvis menneskelige 3D lunge vev kulturer fra agarose fylt PCLS gi en kompleks menneskelige modellen for å studere lunge fysiologi og sykdommer. Protokollen gir en detaljert beskrivelse av utarbeidelse av PCLS fra resected lungevev og deres dyrking og videre løser utfordringer i agarose fylling av menneskelig lunge resections og hvor å overvinne dem.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlig til Marisa Neumann for ekspert teknisk assistanse. Alle lunge vev var vennlige gitt av CPC-M Bio-arkivet. Dette arbeidet ble støttet av tysk midten av lunge forskning (DZL), Helmholtz Association og CPC forskning skole tilskudd.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |