At studere Protein Import til grønkorn ved hjælp af Protoplasts
Summary
Her beskriver vi en protokol for at udtrykke proteiner i protoplasts ved hjælp af PEG-medieret transformation metode. Metoden giver nem udtryk af proteiner af interesse og effektiv undersøgelse af protein lokalisering og importprocessen for forskellige eksperimentelle betingelser in vivo.
Abstract
Chlorplasttransitpeptidsekvensen er en afgørende organelle, der er ansvarlig for forskellige cellulære processer i planter, såsom fotosyntese og produktion af mange sekundære metabolitter og lipider. Kloroplaster kræver et stort antal proteiner for disse forskellige fysiologiske processer. Over er 95% af grønkorn proteiner kernen-kodet og importerede i grønkornene fra cytosol efter oversættelse på cytosole ribosomer. Således, den rette import- eller målretning af disse kerne-kodet grønkorn proteiner til kloroplaster er afgørende for et velfungerende grønkorn samt plante celle. Nucleus-kodet grønkorn proteiner indeholder signal sekvenser for specifikke målretning til grønkorn. Molekylære maskineri lokaliseret til grønkorn eller cytosol genkende disse signaler og udføre importprocessen. For at undersøge mekanismerne af protein import eller målretning til kloroplaster i vivo, udviklede vi en hurtig, effektiv protoplast-baseret metode til at analysere protein import til kloroplaster i Arabidopsis. I denne metode bruger vi protoplasts isoleret fra blad væv i Arabidopsis. Her give vi en detaljeret protokol for at bruge protoplasts til at efterforske den mekanisme, hvormed proteiner er importeret til grønkorn.
Introduction
Chlorplasttransitpeptidsekvensen er en af de vigtigste organeller i planter. En af de vigtigste funktioner i kloroplaster er at foretage fotosyntese1. Kloroplaster også udføre mange andre biokemiske reaktioner for produktionen af fedtsyrer, aminosyrer, nukleotider og talrige sekundære metabolitter1,2. For alle disse reaktioner kræver grønkorn et stort antal forskellige typer af proteiner. Grønkorn genom indeholder imidlertid kun ca. 100 gener3,4. Derfor skal grønkorn importere størstedelen af deres proteiner fra cytosol. Faktisk var de fleste grønkorn proteiner vist skal importeres fra cytosol efter oversættelse4,5,6. Planteceller kræver særlige mekanismer til at importere proteiner fra cytosol til grønkorn. Men selv om disse protein import mekanismer er blevet undersøgt for de sidste mange årtier, vi stadig fuldt ud forstår dem ikke på molekylært niveau. Her give vi en detaljeret metode til at forberede protoplasts og eksogent giver udtryk for gener i protoplasts. Denne metode kunne være værdifuld for belyse de molekylære mekanismer bag protein import til kloroplaster i detaljer.
Protein import kan studeres ved hjælp af mange forskellige tilgange. En af disse metoder indebærer anvendelse af en in vitro- protein import system7,8. Ved hjælp af denne fremgangsmåde i vitro-oversatte protein prækursorer inkuberes med renset kloroplaster i in vitro, og protein import er analyseret af SDS-PAGE efterfulgt af western blot analyse. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at hvert trin af protein import i grønkornene kan studeres i detaljer. Således, denne metode har været meget anvendt til at definere komponenter af protein import molekylære maskineri og dissekere sekvens information til transit peptider. For nylig, en anden tilgang, der involverer brugen af protoplasts fra blad væv blev udviklet og det er blevet udbredt at studere protein import til grønkorn9,10. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at protoplasts giver en cellulære miljø, der er tættere på intakt celler end in vitro -system. Således tillader protoplast systemet os at løse mange flere aspekter af denne proces, som de tilknyttede cytosole begivenheder og hvordan specificitet målretning signaler bestemmes. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for brug af protoplasts til at undersøge protein import i grønkornene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi givet en detaljeret protokol for brug af protoplasts i Arabidopsis at studere protein import i grønkornene. Denne metode er stærk til at undersøge protein importprocessen. Denne enkle, alsidige teknik er nyttig for behandlingen af målretning af de påtænkte cargo proteiner til grønkorn. Du bruger denne metode, er protoplasts fremstillet af blad væv i Arabidopsis11,12 , som kan fås fra planter på mange forskellige vækststadierne spæ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev udført med støtter af Cooperative Research Program for landbrug videnskab og teknologiudvikling (projekt nr. PJ010953012018), landdistrikternes udvikling Administration og National Research Foundation (Korea) tilskud finansieret af Ministeriet for videnskab og IKT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Sydkorea.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
