原生质体在叶绿体中导入蛋白质的研究
Summary
在这里, 我们描述了一种协议, 以表达蛋白质原生质体使用 peg 介导的转化方法。该方法为感兴趣的蛋白质的表达提供了方便的方法, 有效地研究了蛋白质定位和各种实验条件在体内的导入过程。
Abstract
叶绿体是一个重要的细胞器, 负责植物的各种细胞过程, 如光合作用和许多次生代谢物和脂类的产生。叶绿体需要大量的蛋白质来处理这些不同的生理过程。95% 以上的叶绿体蛋白是核编码的, 在细胞核糖体上翻译后从细胞溶胶中导入叶绿体。因此, 将这些核编码的叶绿体蛋白适当导入或靶向叶绿体对于叶绿体和植物细胞的正常运作至关重要。核编码叶绿体蛋白包含特定于叶绿体的信号序列。分子机械定位到叶绿体或细胞溶胶识别这些信号并进行导入过程。为了研究蛋白质在体内导入或靶向叶绿体的机制, 我们开发了一种快速、高效的原生质体基方法来分析蛋白质导入拟南芥叶绿体的情况。在这种方法中, 我们使用从拟南芥叶片组织中分离出的原生质体。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 用于使用原生质体来研究蛋白质导入叶绿体的机制。
Introduction
叶绿体是植物中最重要的细胞器之一。叶绿体的主要功能之一是进行光合作用1。叶绿体还为脂肪酸、氨基酸、核苷酸和许多次生代谢物1, 2 的产生进行许多其他生化反应。对于所有这些反应, 叶绿体需要大量不同类型的蛋白质。然而, 叶绿体基因组只包含大约100个基因3,4。因此, 叶绿体必须从细胞溶胶中导入大部分蛋白质。事实上, 大多数叶绿体蛋白被证明是在翻译4,5,6后从细胞溶胶中导入的。植物细胞需要特定的机制来从细胞溶胶导入蛋白质到叶绿体。然而, 尽管这些蛋白质进口机制在过去几十年里一直在研究, 但我们仍然没有在分子层面上完全理解它们。在这里, 我们提供了一个详细的方法来制备原生质体和外生表达基因在原生质体。该方法可用于阐明蛋白质导入叶绿体的分子机制。
蛋白质的导入可以用许多不同的方法来研究。其中一种方法涉及使用体外蛋白质导入系统7,8。利用该方法,体外转化蛋白前体体体培养纯化的叶绿体, 用 sds-page 对蛋白质导入进行分析, 然后进行西方印迹分析。这种方法的优点是可以详细研究蛋白质导入叶绿体的每一步。因此, 该方法已被广泛用于定义蛋白质导入分子机械的成分, 并对过境肽的序列信息进行剖析。最近, 开发了另一种涉及使用叶组织原生质体的方法, 并已被广泛用于研究蛋白质导入叶绿体9,10.这种方法的优点是原生质体提供了一个比体外系统更接近完整细胞的细胞环境。因此, 原生质体系统使我们能够解决这一过程的许多其他方面, 如相关的细胞质事件, 以及如何确定靶向信号的特异性。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 用于使用原生质体研究蛋白质的进口到叶绿体。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们提供了一个详细的方案, 用于使用拟南芥原生质体研究蛋白质进口到叶绿体。该方法对研究蛋白质导入过程具有很强的功能。这种简单、通用的技术可用于检查预定货物蛋白的靶向叶绿体。利用该方法, 从拟南芥11、12的叶片组织中提取原生质体, 可在从非常早期到完全成熟的叶片的许多不同生长阶段提取原生质体。然而, 在种植用于原?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是在农业科技发展合作研究方案 (项目号) 的支持下进行的。pj010953012018), 政府农村发展管理局和国家研究基金会 (韩国) 赠款, 由科学和信息和通信技术部资助 (no. 2016r1e1a1a02922014), 大韩民国。
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
