Studere Protein Import i Chloroplasts bruker Protoplasts
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å uttrykke proteiner i protoplasts ved hjelp av PEG-mediert transformasjon metode. Metoden gir enkel uttrykk for proteiner av interesse og effektiv undersøkelse av protein lokalisering og importprosessen for ulike eksperimentelle forhold i vivo.
Abstract
Chloroplast er en viktig organelle som er ansvarlig for ulike cellulære prosesser i planter, som fotosyntesen og produksjon av mange sekundære metabolitter og lipider. Chloroplasts krever et stort antall proteiner for disse ulike fysiologiske prosesser. Over er 95% av chloroplast proteiner kjernen-kodet og importeres til chloroplasts fra stoffer etter oversettelse på cytosolic ribosomer. Dermed er riktig import eller målretting av disse kjernen-kodede chloroplast proteiner til chloroplasts avgjørende for riktig funksjon av chloroplasts samt anlegget celle. Kjerne-kodede chloroplast proteiner inneholder signal sekvenser for bestemte målretting for chloroplasts. Molekylær maskiner lokalisert til chloroplast eller stoffer gjenkjenne disse signalene og utføre importen. Undersøke mekanismer av protein import eller målretting chloroplasts i vivo, utviklet vi en rask, effektiv protoplast-basert metode for å analysere protein import i chloroplasts av Arabidopsis. I denne metoden bruker vi protoplasts isolert fra blad vev av Arabidopsis. Her gir vi en detaljert protokoll for å bruke protoplasts for å undersøke mekanismen som proteiner er importert til chloroplasts.
Introduction
Chloroplast er en av de viktigste organeller i planter. En av Hovedfunksjonene til chloroplasts er å gjennomføre fotosyntese1. Chloroplasts også utføre mange andre biokjemiske reaksjoner for produksjon av fettsyrer, aminosyrer, nukleotider og mange sekundære metabolitter1,2. For alle disse reaksjonene krever chloroplasts et stort antall forskjellige typer proteiner. Chloroplast genomet inneholder imidlertid bare ca 100 gener3,4. Chloroplasts må derfor importere fleste av sine proteiner fra stoffer. Faktisk ble de fleste chloroplast proteiner vist importeres fra stoffer etter oversettelse4,5,6. Anlegget celler krever spesifikke mekanismene importere proteiner fra stoffer til chloroplasts. Men selv om disse protein import mekanismene er gransket for de siste tiårene, forstår vi fortsatt ikke fullt ut dem på molekylært nivå. Her gir vi en detaljert metode for utarbeidelse protoplasts og exogenously uttrykke genene i protoplasts. Denne metoden kan være nyttig for Klargjørende molekylære mekanismer underliggende protein import i chloroplasts i detalj.
Protein import kan studeres ved hjelp av mange ulike tilnærminger. En av disse metodene innebærer bruk av en i vitro protein import system7,8. Bruker denne tilnærmingen, i vitro-oversatt protein prekursorer er ruges med renset chloroplasts i vitro, og protein import analyseres av SDS side etterfulgt av western blot analyse. Fordelen med denne tilnærmingen er at hvert trinn av protein import i chloroplasts kan bli studert i detalj. Dermed har denne metoden vært mye brukt til å definere komponentene i protein import molekylær maskiner og dissekere oppstartsrekkefølgen for transitt peptider. Flere nylig, en annen tilnærming med bruk av protoplasts fra blad vev ble utviklet og det har blitt mye brukt til å studere protein import i chloroplasts9,10. Fordelen med denne tilnærmingen er at protoplasts gir et mobilnettet miljø som er nærmere til intakt celler enn i vitro system. Dermed tillater protoplast systemet oss å ta mange flere aspekter av denne prosessen, som tilknyttede cytosolic hendelsene og hvordan spesifisiteten av målretting signaler bestemmes. Her presenterer vi en detaljert protokoll for bruk av protoplasts å studere protein import i chloroplasts.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har gitt en detaljert protokoll for bruk av protoplasts av Arabidopsis å studere protein import i chloroplasts. Denne metoden er kraftig for å undersøke protein importprosessen. Denne enkle, allsidig teknikken er nyttig for å undersøke målretting av de tiltenkte Last proteinene til chloroplasts. Bruker denne metoden, er protoplasts forberedt fra blad vev Arabidopsis11,12 som kan fås fra planter i mange forskjellige vekst stadier, fra v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble utført med støtte Cooperative Research Program for landbruk vitenskap og teknologiutvikling (Project nr. PJ010953012018), Rural Development administrasjon og National Research Foundation (Korea) stipendet finansiert av departementet for vitenskap og IKT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Sør-Korea.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
