Her beskriver vi en protokoll for generering av kationisk nanoliposomes, som er basert på metoden tørrfilm og kan brukes for trygg og effektiv levering av in vitro transkribert budbringer RNA.
Utviklingen av budbringer RNA (mRNA)-basert therapeutics for behandling av ulike sykdommer blir stadig viktigere på grunn av positive egenskapene til i vitro transkribert (PES) mRNA. Med hjelp av IVT mRNA, kan de novo syntesen av et protein som ønsket indusert uten endring av fysiologiske status for målcellen. Videre kan protein biosyntesen kontrolleres nøyaktig på grunn av forbigående effekten av IVT mRNA.
For effektiv transfection celler, kan nanoliposomes (NLps) representere en sikker og effektiv levering kjøretøy for terapeutisk mRNA. Denne studien beskriver en protokoll for å generere sikker og effektiv kationisk NLps bestående av DC-kolesterol og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (dop) som en vektor for levering for IVT mRNA. NLps har en definert størrelse, en homogen distribusjon og en høy complexation kapasitet, og kan produseres med metoden tørrfilm. Videre vi presenterer ulike testsystemer å analysere sine complexation og hva efficacies bruker syntetiske forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP) mRNA, samt deres innvirkning på celle levedyktighet. Samlet gir presentert protokollen en effektiv og trygg tilnærming for mRNA complexation, som kan fremme og forbedre administrasjonen av terapeutiske mRNA.
Bruk av modifisert mRNA for terapeutiske programmer har vist stort potensial i de siste par årene. I hjerte, provoserende og monogenetic sykdommer og utvikle vaksiner, er mRNA en lovende terapeutisk agent1.
Protein erstatning terapi med mRNA tilbyr flere fordeler sammenlignet med den klassiske genterapi, som er basert på DNA hva til målet celler2. Funksjonen mRNA starter direkte i stoffer. Men plasmider DNA (pDNA), en konstruksjon av double-strandet, rund kan DNA som inneholder en promoter region og gene serie koding terapeutiske protein3, også handlinger i stoffer det bare inkluderes i celler som går gjennom mitose ved transfection. Dette reduserer antall transfekterte celler i vevet1,4. Hva av vev med svak mitose aktivitet, for eksempel hjerte celler, er spesielt vanskelig5. I motsetning til pDNA oppstår hva og oversettelse av mRNA i mitotisk og ikke-mitotisk celler i vevet1,6. Viral integrering av DNA i vert genomet kan komme med mutagene effekter eller immunreaksjoner7,8, men etter hva av celler med en protein-koding mRNA, ønsket protein syntese de novo starter selvstendig9,10. Videre kan proteinsyntese justeres til pasientens behov gjennom personlige doser, uten å forstyrre genomet og risikere mutagene effekter11. Aktivering av immun potensialet i syntetisk genererte mRNA kunne reduseres dramatisk med pseudo uridine og 5-methylcytidine i stedet for uridine og cytidine12. Pseudo uridine endret mRNA har også vist seg å ha en økt biologiske stabilitet og en betydelig høyere translasjonsforskning kapasitet13.
For å kunne dra nytte av de lovende egenskapene av mRNA-basert behandling av klinisk bruk, er det viktig å lage en passende bil for transport av mRNA inn i cellen. Dette kjøretøyet skal bære giftfri egenskaper i vitro og vivo, beskytte mRNA mot nuclease-degradering og gi tilstrekkelig mobilnettet opptak for en langvarig tilgjengelighet og oversettelse av de mRNA14.
Blant alle mulige transportør typer i vivo stoffet levering, som Karbonnanorør kvante prikker og liposomer, sistnevnte har vært studert de15,16. Liposomer er blemmer som består av en lipid bilayer10. De er amphiphilic med en hydrofobe og en hydrofile del, og selv hvordan disse molekylene, et sfærisk dobbelt lag er dannet17. I liposomer, kan terapeutiske agenter eller narkotika være innkapslet og dermed beskyttet enzymatisk degradering18. Liposomer inneholder N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20, og dioctadecylamidoglycylspermine (hunder)21, eller DC-kolesterol22, er vel preget og brukte for mobilnettet transfection med DNA eller RNA.
Kationisk liposomer utgjør en positivt ladet lipid og en uncharged phospholipid23. Hva via kationisk liposomer er en av de vanligste metodene for transport av nukleinsyrer til celler24,25. Kationisk lipid partikler danner komplekser med negativt ladde fosfat grupper i ryggraden i nukleinsyre molekyler26. Disse såkalte lipoplexes legge til overflaten av cellemembranen og angi cellen gjennom endocytose eller endocytose-lignende-mekanismer27.
I 1989, Malone et al. vellykket beskrevet kationisk lipid-formidlet mRNA transfection28. Men fant bruker en blanding av DOTMA og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (dop), gruppen at DOTMA manifestert cytotoksiske effekter28. I tillegg viste Zohra et al. at DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propan klorid) kan brukes som en mRNA transfection reagens29. Men for den effektive transfection celler, bør DOTAP brukes i kombinasjon med andre reagenser, som fibronectin29 eller DOPE30. Så langt var DOTMA den første kationisk lipid på markedet brukes for gen levering31. Andre lipider brukes som terapeutiske bærere eller blir testet i ulike stadier av kliniske forsøk, (f.eks EndoTAG-I, som inneholder DOTAP som en lipid bærer), undersøkes for tiden i en fase II kliniske prøve32.
Dette verket beskriver en protokoll for generering av NLps som inneholder DC-kolesterol og dop. Denne metoden er enkel å utføre og tillater generering av NLps av forskjellige størrelser. Vårt generelle mål om NLp generasjon med metoden tørrfilm er å skape liposomer for mRNA complexation, dermed gir effektiv og biokompatible celle transfection i vitro14,33.
Presentert protokollen beskriver generasjonen av NLps med høy innkapsling virkningen for syntetisk endret mRNA og pålitelig transfection celler i vitro. Videre garanterer NLps utgivelsen av mRNA, som igjen oversettes til en funksjonell protein i cellene. I tillegg transfections ved hjelp av NLps kan utføres i vanlig celle medium, som resulterer i høy celle viabilities under transfection og sist opp til tre dager etter hva.
For å bruke mRNA som en terapeutisk, foretrekkes selvsten…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |