Ici nous décrivons un protocole pour la génération de nanoliposomes cationiques, qui repose sur la méthode sèche-film et peut être utilisé pour la sécurité et la prestation efficace de in vitro transcrit l’ARN messager.
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Article de méthode
Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de In Vitro transcrit l’ARN messager
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement de l’ARN messager (ARNm)-fonction thérapeutique pour le traitement de diverses maladies devient plus important à cause de la positive propriétés de in vitro transcrit mRNA (IVT). Avec l’aide de l’ARNm de l’IVT, la synthèse de novo d’une protéine désirée peut être induite sans changer l’état physiologique de la cellule cible. En outre, biosynthèse des protéines peut être contrôlée avec précision en raison de l’effet transitoire du mRNA IVT.
Pour la transfection efficace des cellules, nanoliposomes (PNV) peut représenter un véhicule de livraison sûre et efficace pour l’ARNm thérapeutique. Cette étude décrit un protocole pour générer sûre et efficace cationique PNV composée de DC-cholestérol et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) comme un vecteur de livraison d’ARNm IVT. PNV ayant une taille, une répartition homogène et une capacité élevée de complexation et peut être produites à l’aide de la méthode sèche-film. Par ailleurs, nous présentons des systèmes de test différent afin d’analyser leur complexation et efficacité de transfection utilisant synthétique renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) mRNA, ainsi que leur effet sur la viabilité des cellules. Globalement, le protocole présenté fournit une approche efficace et sans danger pour la complexation d’ARNm, qui peut faire avancer et améliorer l’administration de l’ARNm thérapeutique.
Introduction
L’utilisation du mRNA modifiés pour des applications thérapeutiques a montré beaucoup de potentiel dans les deux dernières années. Maladies cardiovasculaires, inflammatoires et monogénique, ainsi que dans le développement de vaccins, l’ARNm est agent thérapeutique prometteur1.
Thérapie de remplacement de protéines avec l’ARNm offre plusieurs avantages sur la thérapie génique classique, qui repose sur la transfection d’ADN dans les cellules de cible2. La fonction ARNm lance directement dans le cytosol. Bien que le plasmide ADN (pDNA), une construction de double-brin, circulaire ADN contenant un....
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Protocole
1. génération de Nanoliposomes cationique (Figure 1)
- Dissoudre les lipides DC-cholestérol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholestérol chlorhydrate) et DOPE (dioléoyl phosphatidyléthanolamine), livrés sous forme de poudre, dans le chloroforme à une concentration finale de 25 mg/mL.
Note : Stocker les lipides dissous à-20 ° C. - Travailler avec 25 mg/mL de solution de ces deux lipides. Mix 40 µL de la DC-cholestérol dissous et 80 µL de la DOPE dissoute dans un flacon en verre.
Remarque : La quantité de lipides totaux est de 3 mg. Pour éviter une évaporation rapide du chloroforme, placez les lipides sur ....
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Résultats
En utilisant le protocole comme décrit, PNV consistant en des lipides DC-cholestérol et DOPE ont été préparés selon la méthode de sec-film (Figure 1). Pendant la préparation, la solution de nanoliposome montre différentes étapes de la turbidité (Figure 2).
L’efficacité de l’encapsulation de la PNV peut ensuite être analysée après l’encapsulation de 1 µg d’ARNm codant eG.......
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Discussion
Le protocole présenté décrit la génération du PNV avec efficacité d’encapsulation élevée d’ARNm synthétiquement mis à jour le, ainsi que la fiabilité transfection des cellules in vitro. En outre, le PNV garantie la libération des ARNm, qui à son tour, est traduit en une protéine fonctionnelle à l’intérieur des cellules. En outre, les transfections utilisant le PNV peut être effectuée dans un milieu ordinaire cellulaire, résultant en grande viabilité de cellules au cours de la transfection, et durer jusqu'à trois.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| (Bromure de cholestérol (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Allemagne | A2231 | |
| (3&beta ;-[N&prime ;,N&prime ;--diméthylaminoéthane)-carbamoyl]chlorhydrate de cholestérol (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, États-Unis | 700001 | |
| 4 ; &prime ;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | D1306 | |
| BD Système FACScan | BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne | 340181 | |
| Chloroforme | Merck, Darmstadt, Allemagne | 102445 | |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Allemagne | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, États-Unis | 850725 | |
| Microscope à fluorescence | Zeiss Axio, Oberkochen, Allemagne | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | 11668019 | |
| Mini extrudeuse | Avanti, Alabama, États-Unis | ||
| Eau sans nucléases | Qiagen, Hilden, Allemagne | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | 11058021 | |
| tampon PBS (sans Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | 70011044 | |
| Kit de réactifs d’ARN Quant-iT Ribo Green | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | Q33140 | |
| RPMI (sans rouge de phénol) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | 11835030 | |
| Gel de silice | Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne | P077 | |
| Trypsine/EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | 25300054 | |
| Kit de polymérase HotStar HiFidelity | Qiagen, Hilden, Allemagne | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Allemagne | 28104< | |
| br/> Pseudouridine-5'-triphosphate (&Psi ;-UTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, États-Unis | N-1019 | |
| 5-méthylcytidine-5'-triphosphate (méthyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, États-Unis | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Allemagne | ||
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Allemagne | 74104 | |
| Kit de transcription MEGAscript T7 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | AM1333 | |
| 3´ ;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Structure du chapeau d’ARN Analogique | New England Biolabs, Ipswich, États-Unis | S1411L | |
| Phosphatase antarctique | Nouveau Angleterre Biolabs, Ipswich, États-Unis | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, États-Unis | 41003 | |
| peqGOLD Mélange d’échelle d’ADN | VWR, Pennsylvanie, | États-Unis 25-2040 | |
| Invitrogen 0,5-10 kb Échelle d’ARN | Fisher Scientific, Gö ; teborg, Suède | 11528766 |
Références
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., King....
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Réimpressions et autorisations
