Здесь мы описываем протокол для поколения катионного nanoliposomes, который основан на методе сухой фильм и может использоваться для безопасного и эффективного предоставления в vitro транскрипции РНК.
Разработка матричная РНК (мРНК)-на основе терапии для лечения различных заболеваний становится все более важным из-за положительные свойства в vitro трансляции мРНК (IVT). С помощью IVT мРНК de novo синтез желаемого белка может быть вызван без изменения физиологического состояния целевой ячейки. Кроме того Биосинтез белка может точно управляться из-за переходного эффекта ИВТ мРНК.
Для эффективного transfection клетки nanoliposomes (NLps) может представлять средство безопасной и эффективной доставки для терапевтических мРНК. Это исследование описывает протокол для создания безопасной и эффективной катионного NLps состоящий из DC-холестерина и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДОПИНГ) как вектор доставки для ИВТ мРНК. NLps, имеющие определенный размер, однородное распределение и высокая комплексообразованию потенциала и могут быть изготовлены с использованием метода сухой фильм. Кроме того, мы представляем различные тест-систем для анализа их комплексообразования и трансфекции узкоспециализированного с использованием синтетических расширение Зеленый флуоресцентный белок (eGFP) мРНК, а также их влияние на жизнеспособность клеток. В целом представленные протокол обеспечивает эффективный и безопасный подход мРНК комплексообразование, который может заранее и улучшить администрации терапевтических мРНК.
Использование модифицированных мРНК для терапевтического применения показывает большой потенциал в последние пару лет. В моногенетическими, сердечно-сосудистой и воспалительных заболеваний, а также в разработке вакцин мРНК является перспективным терапевтический агент1.
Белка заместительной терапии с мРНК предлагает несколько преимуществ по сравнению с классической генная терапия, которая основана на ДНК трансфекции в целевой ячейки2. МРНК функция инициирует непосредственно в цитозоль. Хотя плазмидной ДНК (pDNA), конструкция двунитевая, циркуляр ДНК, содержащие промоутер региона и последовательности гена кодирования терапевтических белков-3, также акты в цитозоле, оно может только быть включены в клетки, которые проходят митоз в то время transfection. Это уменьшает количество transfected клеток в тканях1,4. В частности transfection тканей с слабой митоз активности, таких как сердечные клетки, является трудно5. В отличие от pDNA transfection и перевод мРНК происходят в митотическая и не митотическая клеток в ткани1,6. Вирусная интеграции ДНК в хост геномов может прийти с мутагенных эффектов или иммунных реакций7,8, но после transfection клетки с мРНК белка кодирования, de novo синтез белка желаемого начинает самостоятельно9,10. Кроме того синтез белков может быть скорректирована именно к потребности пациента путем индивидуальных доз, без вмешательства с геном и рискуя мутагенных эффектов11. Иммунной активации потенциал искусственно созданного мРНК может быть значительно снижен с помощью псевдо-уридина и 5′-methylcytidine вместо уридина и Цитидин12. Псевдо-уридина модифицированных мРНК также было показано повышение биологической стабильности и значительно выше трансляционная потенциала13.
Чтобы иметь возможность воспользоваться перспективных свойств на основе мРНК терапии в клинических приложений, важно создать подходящее транспортное средство для перевозки мРНК в клетку. Этот автомобиль должен нести нетоксичные свойства в пробирке и в естественных условиях, защитить против нуклеиназы деградации мРНК и обеспечивают достаточно клеточного поглощения для длительного доступности и перевод мРНК14.
Среди всех типов возможных перевозчика в естественных условиях доставки наркотиков, например, углеродных нанотрубок, квантовые точки и липосомы, последние были изучены наиболее15,16. Липосомы являются везикулы, состоящий из липидного бислоя10. Они амфифильных с гидрофобных и гидрофильных секции, и через самостоятельной расположение этих молекул, сферические двойной слой является форматом17. Внутри липосомы терапевтических агентов или наркотиков можно инкапсулировать и, таким образом, защищен от18энзимной деградации. Липосомы, содержащие N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium хлорид (DOTMA)19, [1,2-бис (oleoyloxy) -3-пропан (trimethylammonio)] (DOTAP)20и21dioctadecylamidoglycylspermine (собаки), или DC-холестерин22, хорошо характеризуется и часто используется для сотовых трансфекции с ДНК или РНК.
Катионный липосомы составляют положительно заряженных липидов и незаряженных фосфолипидного23. Трансфекция через Катионный липосомы является одним из наиболее распространенных методов для перевозки нуклеиновых кислот в клетки24,25. Катионоактивный липид частицы образуют комплексы с отрицательно заряженных фосфатными группами в основу нуклеиновых кислот молекул26. Эти так называемые lipoplexes придают поверхности клеточной мембраны и войти в камеру через эндоцитоз или эндоцитоза как механизмы27.
В 1989 году Мэлоун и др. успешно описал катионоактивный липид опосредованной мРНК трансфекции28. Однако используя смесь DOTMA и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДОПИНГ), Группа обнаружила, что DOTMA проявляется цитотоксических эффектов28. Кроме того Зохра et al. показал, что DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-триметиламмония пропан хлорид) может использоваться как реагент мРНК в трансфекции29. Однако для эффективного transfection клетки, DOTAP должен использоваться в сочетании с другими реагенты, такие как фибронектин29 или30ДОПИНГ. Пока DOTMA был первым Катионный липидов на рынке, используемых для доставки генов31. Другие липиды используются как терапевтические перевозчиков или тестируются на разных стадиях клинических испытаний, (например, EndoTAG-I, содержащее DOTAP как перевозчик липидов), в настоящее время изучается в фазы II клинических судебного32.
Эта работа описывает протокол для поколения NLps, содержащих DC-холестерин и ДОПИНГ. Этот метод легко выполнить и позволяет генерировать NLps разных размеров. Общая цель НЛП поколения, с помощью метода сухой фильм является создание липосом для комплексообразованию мРНК, таким образом позволяя transfection клеток эффективным и биосовместимых в vitro14,33.
Представленные протокол описывает поколения NLps с высоким инкапсуляции эффективность для искусственно модифицированных мРНК, а также надежных transfection клетки в пробирке. Кроме того NLps гарантируют освобождение мРНК, который в свою очередь, будет переведен на функциональных белков в…
The authors have nothing to disclose.
Нет
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |