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Bio-ingénierie

Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.

Abstract

El desarrollo de RNA mensajero (mRNA)-base terapéutica para el tratamiento de diversas enfermedades, se convierte cada vez más importante debido a la positiva propiedades de in vitro transcripción mRNA (IVT). Con la ayuda de mRNA IVT, puede inducirse la síntesis de novo de una proteína deseada sin necesidad de cambiar el estado fisiológico de la célula diana. Por otra parte, biosíntesis de la proteína pueden ser precisamente controlada debido al efecto transitorio del mRNA IVT.

Para la transfección eficiente de células, nanoliposomas (NLps) pueden representar un vehículo de entrega segura y eficiente para el mRNA terapéutico. Este estudio describe un protocolo para generar seguro y eficiente catiónico NLps compuesto de colesterol DC y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como un vector de la entrega para IVT mRNA. NLps tener definido el tamaño, una distribución homogénea y una capacidad de complejación alta y puede ser producidos utilizando el método de película seca. Por otra parte, presentamos sistemas de prueba diferentes para analizar la complejación y eficacias de transfección con sintético mejorado proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, así como su efecto en la viabilidad celular. En general, el protocolo presentado proporciona un acercamiento eficaz y seguro para la complejación de mRNA, que puede avanzar y mejorar la administración de terapéutica mRNA.

Introduction

El uso de ARNm modificado para aplicaciones terapéuticas ha mostrado gran potencial en los últimos años. En enfermedades cardiovasculares, inflamatorias y monogenéticos, así como en el desarrollo de vacunas, el mRNA es un prometedor agente terapéutico1.

Terapia de reemplazo de la proteína con el mRNA ofrece varias ventajas sobre la terapia del gene clásico, basado en la transfección de la DNA en las células de destino2. La función de mRNA se inicia directamente en el citosol. Aunque el plásmido ADN (pDNA), una construcción de doble cadena, circular ADN que contiene una región promotora y una secuencia del gen que codifican la proteína terapéutica3, también actúa en el citosol, puede sólo ser incorporado en células que van a través de la mitosis en el momento de la transfección. Esto reduce el número de células transfected en el tejido1,4. Específicamente, la transfección de los tejidos con actividad de mitosis débiles, tales como células cardíacas, es difícil5. En contraste con pDNA, la transfección y traducción de mRNA ocurren en las células mitotic y no mitótica del tejido1,6. La integración viral de la DNA en el genoma del anfitrión puede venir con efectos mutagénicos o reacciones inmunes7,8, pero después de la transfección de células con una codificación de la proteína ARNm, la síntesis de novo de la proteína deseada inicia autónomamente9,10. Por otra parte, la síntesis de proteínas puede ajustarse precisamente a la necesidad del paciente a través de dosis individuales, sin interferir en el genoma y correr el riesgo de efectos mutagénicos11. El potencial de activación inmune de mRNA sintético generado podría reducirse drásticamente mediante pseudo uridina y 5′-methylcytidine en lugar de uridina y citidina12. Pseudo uridina mRNA modificada también se ha demostrado tener una mayor estabilidad biológica y una significativamente mayor capacidad traslacional13.

Para poder beneficiarse de las prometedoras propiedades de tratamiento basado en el mRNA en aplicaciones clínicas, es esencial para crear un vehículo adecuado para el transporte de ARNm en la célula. Este vehículo debe tener propiedades no tóxico en vitro e in vivo, proteger el mRNA contra degradación nucleasas y proporcionar suficiente absorción celular para una prolongada disponibilidad y traducción de los mRNA de14.

Entre todos los tipos de portador posible para en vivo entrega de la droga, tales como nanotubos de carbono puntos cuánticos y liposomas, estos últimos han sido estudiados más de15,16. Liposomas son vesículas que consiste en una bicapa de lípidos10. Son anfifílicas con una hidrofóbica y una hidrofílica sección, y a través de la propia disposición de estas moléculas, una doble capa esférica es formado17. Dentro de los liposomas, agentes terapéuticos o medicamentos pueden ser encapsulados y, así, protegidos de la degradación enzimática18. Liposomas que contienen N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20y21de dioctadecylamidoglycylspermine (perros), o DC-colesterol22, están bien caracterizadas y utilizado con frecuencia para transfección celular con ADN o ARN.

Liposomas catiónicos comprenden un lípido positivamente cargado y un fosfolípido23. Través de catiónicos liposomas de transfección es uno de los métodos más comunes para el transporte de los ácidos nucleicos en células24,25. Las partículas de lípidos catiónicos forman complejos con los grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico26. Estos supuestos lipoplexes fije a la superficie de la membrana celular y entrar en la célula mediante endocitosis o mecanismos de endocitosis como27.

En 1989, Malone et al. con éxito se describe catiónico mediada por lípidos mRNA transfección28. Sin embargo, usando una mezcla de DOTMA y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), el grupo encontró que DOTMA manifiesta efectos citotóxicos28. Además, Zohra et al demostró que DOTAP (cloruro de 1, 2-dioleoyloxy-3-trimetilamonio-propano) puede utilizarse como un mRNA de la transfección reactivos29. Sin embargo, para la transfección eficiente de células, DOTAP debe utilizarse en combinación con otros reactivos, tales como fibronectina29 o30de la droga. Hasta ahora, DOTMA era el lípido catiónico primero en el mercado para el gen entrega31. Otros lípidos son utilizados como portadores de la terapéuticos o se están probando en diferentes etapas de ensayos clínicos (p. ej., EndoTAG-I, que contiene DOTAP como portador lípido), actualmente está siendo investigada en un ensayo clínico de fase II32.

Este trabajo describe un protocolo para la generación de NLps que contiene colesterol DC y la droga. Este método es fácil de realizar y permite la generación de NLps de diferentes tamaños. El objetivo general de generación de PNL mediante el método de película seca es crear liposomas para la complejación de mRNA, así permitiendo la transfección eficiente y biocompatibles de la célula en vitro14,33.

Protocol

1. generación de nanoliposomas catiónico (figura 1) Disolver los lípidos colesterol DC (3β-[-(N′,N′-dimethylaminoethane) de N-Carbamoil] colesterol clorhidrato) y DOPE (dioleoyl fosfatidiletanolamina), entregado en forma de polvo, en cloroformo para obtener una concentración final de 25 mg/mL.Nota: Almacenar los lípidos disueltos a-20 ° C. Trabajar con 25 mg/mL de solución stock de ambos lípidos. Mix 40 μl de la DC-colesterol disuelto y 80 μl de la drog…

Representative Results

Utilizando el protocolo como se describe, NLps consisten en los lípidos colesterol DC y la droga fueron preparados utilizando el método de película seca (figura 1). Durante la preparación, la solución nanoliposoma muestra diferentes etapas en turbidez (figura 2). La eficacia de la encapsulación de la NLps luego puede ser analizada después de la encapsulación de …

Discussion

El protocolo presentado describe la generación de NLps con eficacia alta encapsulación de mRNA sintético modificado, así como la fiable transfección de células en vitro. Por otra parte, las NLps garantiza la liberación de ARNm, que a su vez, se traduce en una proteína funcional dentro de las células. Además, las transfecciones con NLps puede realizarse en medio celular regular, dando por resultado alta viabilidades de la célula durante la transfección, y durar hasta tres días después de la transfec…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ninguno

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
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Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
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