Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.
Mesajcı RNA (mRNA) gelişimi-çeşitli hastalıkların tedavisinde olumlu nedeniyle daha fazla önemli hale gelir therapeutics temel özelliklerini vitro transkripsiyonu (IVT) mRNA. IVT mRNA sayesinde, istenilen bir protein de novo sentezi hedef hücre fizyolojik durumunu değiştirmeden bağlı olmak. Ayrıca, protein biyosentezi tam IVT mRNA geçici etkisi nedeniyle kontrol edilebilir.
Hücreleri verimli transfection için nanoliposomes (NLps) tedavi mRNA için güvenli ve verimli teslim araç temsil edebilir. Bu çalışmada DC-kolesterol ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine oluşan güvenli ve verimli katyonik NLps (uyuşturucu) teslimat vektör olarak IVT mRNA için oluşturmak için bir protokol açıklar. Bir tanımlanmış olan NLps, homojen bir dağılım ve yüksek complexation kapasitesi, boyutu ve kuru-film yöntemi kullanılarak üretilen. Ayrıca, biz onların complexation analiz etmek için farklı test sistemleri mevcut ve transfection efficacies sentetik kullanarak gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) mRNA, hem de hücre canlılığı üzerindeki etkileri. Genel olarak, sunulan Protokolü ilerlemek ve terapötik mRNA yönetimini geliştirmek mRNA complexation için etkili ve güvenli bir yaklaşım sağlar.
Değiştirilmiş mRNA kullanımı tedavi uygulamaları için son birkaç yıldır büyük bir potansiyel göstermiştir. Kalp, enflamatuar ve monogenetic hastalıkları, olduğu gibi aşı geliştirme, mRNA bir umut verici terapötik ajan1‘ dir.
Protein replasman tedavisi ile mRNA DNA transfection2hedef hücreleri içine dayalı klasik gen terapisi birkaç avantaj sunar. MRNA işlevi sitozol doğrudan başlatır. Her ne kadar plazmid DNA (pDNA), bir çift iplikçikli yapı, daire organizatörü bölge ve terapötik protein3, ayrıca eylemlere sitozol, kodlama bir gen dizisini içeren DNA bu sadece mitoz gidiyorsun hücrelere dahil edilebilir transfection anda. Bu doku1,4transfected hücrelerin sayısını azaltır. Özellikle, kalp hücreleri gibi zayıf mitoz faaliyeti ile dokuların transfection zor5‘ tir. PDNA aksine, transfection ve çeviri mRNA doku1,6mitotik ve mitotik olmayan hücrelerde ortaya çikmaktadir. Ana bilgisayar genom viral entegrasyon DNA’ın mutajenik etkileri veya bağışıklık tepkileri7,8, ama hücrelerin protein kodlama mRNA, istenen protein de novo sentezi ile transfection sonra gelebilir özerk olarak9,10da başlıyor. Ayrıca, protein sentezi tam için hastanın ihtiyacı aracılığıyla bireysel dozlarda, genom ile müdahale ve mutajenik etkileri11riske olmadan ayarlanabilir. Sentetik oluşturulan mRNA bağışıklık aktive potansiyelini önemli ölçüde sahte üridin ve 5′-methylcytidine ve sitidin Üridin12yerine kullanarak indirdi. Sözde Üridin değiştirilmiş mRNA da artan bir biyolojik istikrar ve anlamlı olarak daha yüksek bir translasyonel kapasitesi13var olduğu gösterilmiştir.
MRNA tabanlı terapi klinik uygulamaları umut verici özelliklerinden yararlanmak için mRNA taşıma hücre içine için uygun bir araç oluşturmak için önemlidir. Bu araç toksik olmayan özellikleri vitro ve in vivoayı, mRNA nükleaz düşmesine karşı korumak ve bir uzun süreli kullanılabilirlik ve mRNA14olan için yeterli hücresel alımını sağlamak.
Karbon nanotüpler, kuantum noktaları ve lipozomlar, gibi vivo içinde ilaç dağıtım için tüm olası taşıyıcı türleri arasında ikinci olmuştur en15,16okudu. Lipozomlar veziküller bir lipid bilayer10/ oluşan vardır. Onlar amfifilik bir hidrofobik ve hidrofilik bir bölüm ile ve bu moleküller öz düzenleme ile küresel bir çift katmanlı kurulan17yaşında. Lipozomlar içinde terapötik ajanlar veya uyuşturucu olabilir kapsüllü ve, böylece, enzimatik Bozulması18korumalı. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium klorür (DOTMA)19, içeren lipozomlar [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20ve dioctadecylamidoglycylspermine (köpek)21, ya da DC-kolesterol22, iyi karakterize ve DNA veya RNA ile hücresel transfection için sık kullanılan.
Katyonik lipozomlar pozitif yüklü bir lipid ve bir doldurulmamış fosfolipid23oluştururlar. Nükleik asitler hücre24,25içine taşınması için en yaygın yöntemlerden birini transfection yolu ile katyonik lipozomlar var. Katyonik lipit parçacıklar kompleksleri olumsuz şarj edilmiş fosfat grupları ile nükleik asit molekülleri26omurgası oluşturmak. Bu sözde lipoplexes hücre membran yüzeyine takın ve endositoz veya endositoz-gibi-mekanizmaları27aracılığıyla hücre girin.
1989 yılında, Malone ve ark. başarıyla katyonik lipit-aracılı mRNA transfection28nitelendirdi. Ancak, bir karışım DOTMA ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (uyuşturucu) kullanarak, Grup DOTMA sitotoksik efekt28tecelli bulundu. Ayrıca, Zohra vd. DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propan klorür) bir mRNA transfection reaktif29kullanılabileceğini gösterdi. Ancak, için verimli transfection hücre DOTAP fibronektin29 veya uyuşturucu30gibi diğer kimyasalları ile birlikte kullanılmalıdır. Şimdiye kadar DOTMA ilk katyonik lipit gen teslim31için kullanılan piyasada oldu. Diğer lipidler tedavi taşıyıcı olarak kullanılan ya da klinik çalışmalarda, farklı aşamalarında test edilen (örneğin, EndoTAG-ı DOTAP lipid taşıyıcı olarak içeren), şu anda bir aşama II klinik deneme32araştırılmaktadır.
Bu eser DC-kolesterol ve uyuşturucu içeren NLps üretimi için bir protokolünü açıklar. Bu yöntemi gerçekleştirmek kolay ve farklı boyutlarda NLps nesil sağlar. Kuru film yöntemi kullanarak NLp üretimi genel amacı lipozomlar mRNA complexation, böylece verimli ve biyouyumlu hücre transfection vitro14,33izin için oluşturmaktır.
Sunulan Protokolü NLps nesil sentetik değiştirilmiş mRNA için yüksek kapsülleme etkinliği ile hem de hücreleri vitrogüvenilir transfection açıklar. Ayrıca, buna karşılık, hücre içinde işlevsel bir protein çevrilmiş mRNA sürümü NLps garanti. Ayrıca, NLps kullanarak transfections normal hücre ortamda gerçekleştirilebilir, yüksek çıkan viabilities transfection sırasında hücre ve üç gün sonra transfection son.
MRNA bir tedavi kullanmak için sistemi te…
The authors have nothing to disclose.
Hiçbiri
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |