عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار
Summary
والهدف العام لهذه المادة توحيد البروتوكول لعزل وتوصيف، وتمايز الخلايا الجذعية القلبية (CSCs) من قلب الماوس الكبار. هنا، يمكننا وصف أسلوب الطرد المركزي تدرج كثافة لعزل CSCs موريني ووضع أساليب لديوان الخدمة المدنية الثقافة وانتشارها، والتمايز في cardiomyocytes.
Abstract
احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن) سبب الرئيسي للاعتلال والوفيات العالم. أحد الأهداف رئيسية للطب التجديدي لتغذية عضلة القلب الميت بعد مي. وقد استخدمت عدة استراتيجيات لتجديد عضلة القلب، العلاج بالخلايا الجذعية لا تزال نهجاً رئيسيا لتغذية عضلة القلب الميت قلب مي. تتراكم الأدلة تشير إلى وجود الخلايا الجذعية القلب المقيم (CSCs) في قلب الكبار وآثارها الغدد الصماء و/أو باراكريني على تجديد القلب. ومع ذلك، CSC عزل وتوصيف والتمايز تجاه الخلايا احتشاء عضلة القلب، ولا سيما كارديوميوسيتيس، لا يزال يشكل تحديا تقنية. في هذه الدراسة، قدمنا طريقة بسيطة لعزل وتوصيف، والتفريق بين CSCs من قلب الماوس الكبار. هنا، يمكننا وصف أسلوب تدرج كثافة لعزل CSCs، حيث يهضم القلب بحل الثاني كولاجيناز 0.2%. تميز CSCs معزولة، يمكننا تقييم التعبير عن علامات CSCs/القلب Sca-1، NKX2-5، و GATA4، وعلامات بلوريبوتينسي/ستيمنيس OCT4، SOX2، ونانج. كما عقدنا العزم إمكانات الانتشار CSCs معزولة باستزراع لهم في طبق بتري وتقييم التعبير عن علامة الانتشار كي-67. لتقييم إمكانيات التمايز CSCs، اخترنا CSCs بين سبع وعشر أيام مثقف. نحن نقلتهم إلى لوحة جديدة مع وسيلة تمايز كارديوميوسيتي. أنها هي المحتضنة في حاضنة ثقافة خلية لمدة 12 يوما، بينما متوسطة التمايز يتم تغييره كل ثلاثة أيام. CSCs المتباينة التعبير عن علامات محددة كارديوميوسيتي: أكتينين وتروبونين أنا. وهكذا، CSCs معزولة مع هذا البروتوكول ستيمنيس وعلامات القلب، ولديهم إمكانيات للانتشار والتفرقة تجاه النسب كارديوميوسيتي.
Introduction
مرض القلب الاقفاري، بما في ذلك احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن)، سبب رئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1. ويظل العلاج بالخلايا الجذعية لتجديد عضلة القلب الميت نهجاً رئيسيا لتحسين وظيفة القلب مي2،القلب3،،من45. استخدمت أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية لتجديد عضلة القلب الميت وتحسين وظيفة القلب قلب مي. يمكن تصنيفها على نطاق واسع في الخلايا الجذعية6 وبالغ في الخلايا الجذعية الجنينية. استخدمت في الخلايا الجذعية البالغة، أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية، مثل الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظام7،8، الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام9،10، الأنسجة الدهنية 11،12، والحبل السري13و14،CSCs15. الخلايا الجذعية يمكن تعزيز إنعاش القلب عن طريق الغدد الصماء و/أو paracrine الإجراءات16،17،18،،من1920. ومع ذلك، قيداً رئيسيا للعلاج بالخلايا الجذعية هو الحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية التي يمكن أن تتكاثر و/أو التفريق نحو21،محددة نسب القلب22. زرع الخلايا الجذعية الذاتي و allogenic يشكل تحديا هاما في العلاج بالخلايا الجذعية9. ويمكن CSCs نهج أفضل لإنعاش القلب نظراً لأنها مشتقة من القلب، وأنها يمكن أن تكون أكثر سهولة متباينة في الأنساب القلب من الخلايا الجذعية غير القلب. وهكذا، فإنه يقلل من خطر تيراتوما. وبالإضافة إلى ذلك، آثار CSCs، والغدد الصماء وباراكريني مثل اكسوسوميس وميرناس المستمدة من CSCs، يمكن أن يكون أكثر فعالية من أنواع أخرى من الخلايا الجذعية. وهكذا، CSCs يبقى خيار أفضل لإنعاش القلب23،24.
على الرغم من أن CSCs أفضل مرشح لتجديد القلب في قلب مي سبب أصلهم القلب، قيداً رئيسيا مع CSCs هو أقل العائد نظراً لعدم وجود طريقة العزل الفعال. قيد آخر يمكن التفريق بين CSCs البصر نحو cardiomyocytes النسب2،25،،من2627. للالتفاف على هذه القيود، من المهم وضع بروتوكول فعال لعزل وتوصيف التمايز تجاه النسب القلب ديوان الخدمة المدنية. هناك لا علامة مقبولة واحدة ل CSCs وعزله محددة سطح الخلية المستندة إلى علامة من CSCs غلة أقل CSCs. هنا، علينا توحيد نهج الطرد المركزي تدرج بسيطة لعزل CSCs من قلب الماوس التي هي فعالة من حيث التكلفة ويؤدي زيادة غلة CSCs. يمكن تحديد هذه CSCs معزولة لعلامات سطح الخلية المحددة بخلية تنشيط fluorescence المكشوف. بالإضافة إلى العزلة CSCs، قدمنا بروتوكولا للثقافة ديوان الخدمة المدنية، وتوصيف والتمايز تجاه النسب كارديوميوسيتي. وهكذا، فإننا نعرض طريقة أنيقة لعزل وتوصيف، الثقافة، والتفريق بين CSCs من قلوب الماوس الكبار (الشكل 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
فيما يلي الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول العزلة ديوان الخدمة المدنية. 1) يجب المحافظة على شرط معقمة لاستخراج القلوب من الفئران. وقد خرق أي تلوث أثناء استخراج قلب نوعية CSCs. 2) يجب إزالة الدم تماما قبل تنميق القلب، والتي تتم بواسطة عدة يغسل القلب كله والقلب القطع مع الحل هبس. 3) يجب أن يكون تفك?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل تدعمه، في أجزاء، منح “المعاهد الوطنية للصحة” HL-113281 و HL116205 إلى الفقرات كومار ميشرا.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction – From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
