Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen
Summary
Das übergeordnete Ziel dieses Artikels soll das Protokoll zur Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen (CSCs) aus dem Herzen der erwachsenen Maus zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine Dichte Gradienten Zentrifugation Methode, murine CSCs zu isolieren und ausgearbeiteten Methoden für CSC-Kultur, Proliferation und Differenzierung in Herzmuskelzellen.
Abstract
Myokardinfarkt (MI) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität auf der ganzen Welt. Ein wesentliches Ziel der regenerativen Medizin ist der Tote Herzmuskel nach MI wieder aufzufüllen. Obwohl mehrere Strategien verwendet wurden, um den Herzmuskel zu regenerieren, bleibt Stammzell-Therapie einen wichtigen Ansatz für Tote Herzmuskel eines MI Herzens wieder aufzufüllen. Beweise sammeln schlägt das Vorhandensein von resident kardiale Stammzellen (CSCs) in das Erwachsene Herz und ihre endokrine und/oder parakrine Effekte auf die kardialen Regeneration. CSC-Isolierung und deren Charakterisierung und Differenzierung in Richtung Herzmuskelzellen, vor allem Kardiomyozyten bleibt jedoch eine technische Herausforderung. In der vorliegenden Studie haben wir eine einfache Methode zur Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von CSCs aus dem Herzen der erwachsenen Maus. Hier beschreiben wir eine Dichte Gradienten Methode zur Isolierung von CSCs, wo das Herz durch eine 0,2 % Kollagenase II Lösung verdaut wird. Um das isolierte CSCs zu charakterisieren, haben wir den Ausdruck von CSCs/Cardiac Marker, Sca-1, NKX2-5 und GATA4 und Pluripotenz/Stemness Marker OCT4, SOX2 und Nanog ausgewertet. Wir bestimmt auch die Proliferation Potenzial der isolierten CSCs durch sie in einer Petrischale züchten und die Bewertung des Ausdrucks der Verbreitung Markierung Ki-67. Für die Bewertung der Differenzierung Potenzial des CSCs, wählten wir sieben – zehn – Tage kultiviert CSCs. Wir übertragen sie auf eine neue Platte mit einem Cardiomyocyte Differenzierung Medium. Sie werden in einer Zelle-Kultur-Inkubator für 12 Tage inkubiert, während die Differenzierung Medium alle drei Tage gewechselt wird. Die differenzierte CSCs express Cardiomyocyte-spezifische Marker: Actinin und Troponin ich. So CSCs isoliert mit diesem Protokoll haben Stemness und kardialen Marker, und sie haben ein Potenzial für Proliferation und Differenzierung in Richtung Cardiomyocyte Abstammung.
Introduction
Ischämische Herzkrankheiten, einschließlich Myokardinfarkt (MI), ist eine der Hauptursachen des Todes rund um die Welt1. Stammzell-Therapie für die Regeneration Tote Herzmuskel bleibt ein wichtiger Ansatz zur Verbesserung der Herzfunktion eine MI Herz2,3,4,5. Verschiedene Arten von Stammzellen haben, Tote Herzmuskel wieder aufzufüllen und die Herzfunktion eines MI Herzens zu verbessern. Sie können im großen und ganzen in6 und Erwachsenen Stammzellen embryonaler Stammzellen eingeteilt werden. In adulten Stammzellen wurden verschiedene Arten von Stammzellen, wie Knochenmark gewonnenen mononukleären Zellen7,8, mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark9,10, Fettgewebe verwendet 11,12, und Nabelschnur13und CSCs14,15. Stammzellen können kardiale Erholung durch endokrine und/oder parakrine Aktionen16,17,18,19,20fördern. Jedoch ist eine große Einschränkung der Stammzell-Therapie eine ausreichende Anzahl von Stammzellen erhalten, das vermehren und/oder gegenüber einem bestimmten kardialen Linie21,22unterscheiden können. Autologen und allogenen Transplantation von Stammzellen ist eine wichtige Herausforderung in Stammzell-Therapie-9. CSCs könnte ein besserer Ansatz zur kardialen Regeneration, denn sie aus dem Herzen stammen und sie können als nicht-kardialen Stammzellen leichter ins Herz Linien differenziert. Also, es reduziert das Risiko von Teratom. Darüber hinaus könnte die endokrinen und parakrine Effekte des CSCs, wie Exosomen und MiRNAs abgeleitet von CSCs, effektiver als andere Arten von Stammzellen. CSCs bleibt daher eine bessere Option für kardialen Regeneration23,24.
Obwohl CSCs ein besserer Anwärter zur kardialen Regeneration in einem MI Herzen aufgrund ihrer kardialen Ursprungs sind, ist eine große Einschränkung mit CSCs weniger Ertrag aufgrund des Fehlens einer effizienten Isolierung-Methode. Eine weitere Einschränkung könnte beeinträchtigt Differenzierung des CSCs in Richtung Herzzellen Lineage2,25,26,27. Um diese Einschränkungen zu umgehen, ist es wichtig, ein effizientes Protokoll für CSC-Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung in Richtung Herz Linie zu entwickeln. Es gibt keine einzige akzeptable Marker für CSCs und eine spezifische Zelloberfläche Marker-basierte Isolation des CSCs ergibt weniger CSCs. Hier, standardisieren wir einen einfachen Farbverlauf Zentrifugation Ansatz zur CSCs aus dem Herzen der Maus zu isolieren, ist kostengünstig und führt zu einer erhöhten Rendite von CSCs. Diese isolierten CSCs können für spezifische Zelloberfläche Marker durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle kurzschließen ausgewählt werden. Neben CSCs isoliert haben wir ein Protokoll für CSC-Kultur, Charakterisierung und Differenzierung gegenüber Cardiomyocyte Abstammung. So präsentieren wir eine elegante Methode um zu isolieren, zu charakterisieren, Kultur, und CSCs von Erwachsenen Mäuseherzen (Abbildung 5) zu unterscheiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die entscheidenden Schritte dieses CSC-Isolierung-Protokolls sind wie folgt. (1) ein sterilisierter Zustand ist für die Extraktion der Herzen von den Mäusen einzuhalten. Eine Kontamination während der Extraktion des Herzens beeinträchtigen die Qualität des CSCs. 2) Blut muss vollständig entfernt werden, bevor trippelnd Herzens, die durch mehrere Wäschen von ganzem Herzen und dem Herzen Stücke mit HBSS Lösung erfolgt. (3) das Herz-Stück müssen vollständig in einer einzelligen Suspension mit Kollagenase Lösung…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird in Teilen, durch die National Institutes of Health Zuschüsse HL-113281 und HL116205, Paras Kumar Mishra unterstützt.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
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