בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים
Summary
המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.
Abstract
אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. יעד מרכזי של רפואה רגנרטיבית היא לחדש את שריר הלב מת לאחר MI. למרות מספר אסטרטגיות שימשו להתחדש שריר הלב, טיפול בתאי גזע נשאר בגישה הגדולות כדי לחדש את שריר הלב מת הלב MI. לצבירת ראיות מצביע על הנוכחות של תאי גזע לב תושב (CSCs) בלב למבוגרים, ההשפעות שלהם אנדוקרינית ו/או paracrine על התחדשות לב. עם זאת, בידוד CSC, שלהם אפיון ובידול לכיוון תאי שריר הלב, במיוחד cardiomyocytes, נותר אתגר טכני. במחקר הנוכחי, סיפקנו שיטה פשוטה עבור בידוד, אפיון, הבידול של CSCs מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה הדרגתי של צפיפות בידודו של CSCs, היכן הלב הוא מתעכל על ידי פתרון II collagenase 0.2%. כדי לאפיין את CSCs מבודדים, הערכנו את הביטוי של סמנים CSCs/לב Sca-1, NKX2-5 ו- GATA4, סמנים pluripotency/stemness OCT4, SOX2 ו- Nanog. אנחנו גם לקבוע את הפוטנציאל התפשטות של CSCs מבודדים על ידי culturing אותם בצלחת פטרי והערכה הביטוי של דה מרקר התפשטות Ki-67. להערכת פוטנציאל התמיינות של CSCs, בחרנו CSCs שבע עד עשר דקות ימים תרבותי. נוכל להעביר אותם צלחת חדשה עם מדיום בידול cardiomyocyte. הם מודגרת ב חממה תרבות התא במשך 12 יום, ואילו המדיום בידול משתנה כל שלושה ימים. CSCs הבדיל אקספרס סמנים ייחודיים cardiomyocyte: actinin, טרופונין אני. לפיכך, CSCs מבודדים עם פרוטוקול זה יש stemness וסמנים לב, שיש להם פוטנציאל התפשטות ובידול לכיוון השושלת cardiomyocyte.
Introduction
מחלת לב איסכמית, כולל אוטם שריר הלב (MI), היא הגורם העיקרי למוות ברחבי העולם1. טיפול בתאי גזע, ולשם רגנרציה שריר הלב מת נשאר בגישה הגדולות כדי לשפר את תפקוד הלב MI הלב2,3,4,5. סוגים שונים של תאי גזע שימשו כדי לחדש את שריר הלב מת וכדי לשפר את תפקוד הלב הלב MI. הם יכולים להיות בהרחבה מחולקת6 תאי גזע עובריים ותאי גזע למבוגרים. בתאי גזע בוגרים, סוגים שונים של תאי גזע היו בשימוש, כמו7,תאי תאי מח עצם-derived8, גזע mesenchymal שמקורם במח העצם9,10, רקמת שומן 11,12, ואת הטבור13ו-14,CSCs15. תאי גזע יכולים לקדם התחדשות לב עד אנדוקרינית ו/או paracrine פעולות16,17,18,19,20. עם זאת, מגבלה עיקרית של טיפול בתאי גזע הוא קבלת מספר תאי גזע יכולים להתרבות ו/או להבדיל לכיוון ספציפי השושלת לב21,22. השתלת עצמיים, allogenic של תאי גזע הוא אתגר חשוב טיפול בתאי גזע9. CSCs יכול להיות שיטה טובה יותר עבור התחדשות לב כי הם נגזרים מתוך הלב, הם יכול להיות בקלות רבה יותר מובחן שושלות לב מאשר בתאי גזע ללא דום לב. לכן, זה מקטין את הסיכון של טרטומה. בנוסף, ההשפעות האנדוקריניות, paracrine של CSCs, כגון exosomes ו- miRNAs נגזר על CSCs, יכול להיות יעיל יותר מאשר סוגים אחרים של תאי גזע. לפיכך, CSCs נשאר אפשרות טובה יותר עבור התחדשות לב23,24.
למרות CSCs מועמד טוב יותר עבור התחדשות לב ליבה MI בשל מוצאם הלב, מגבלה עיקרית עם CSCs הוא פחות תשואה בגלל חוסר של שיטת בידוד יעיל. מגבלה נוספת יכולה להיות הבידול לקוי של CSCs כלפי cardiomyocytes שושלת היוחסין2,25,26,27. כדי לעקוף את המגבלות האלה, חשוב לפתח פרוטוקול יעיל בידוד CSC, אפיון של בידול לכיוון הלב השושלת. אין סמן מקובל יחיד עבור CSCs, ספציפי תא-פני המבוסס על סמן בידוד של CSCs מניב פחות CSCs. כאן, אנחנו לתקנן בגישה פשוטה צנטריפוגה מעבר צבע כדי לבודד CSCs מהלב העכבר זה היא חסכונית ותוצאות תשואה מוגברת של CSCs. CSCs מבודדים אלה ניתן לבחור עבור סמני משטח תאים ספציפיים על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית לקצר. בנוסף CSCs בידוד, סיפקנו פרוטוקול תרבות CSC, אפיון של בידול כלפי השושלת cardiomyocyte. לפיכך, אנו מציגים שיטה אלגנטית כדי לבודד, לאפיין, תרבות, להבדיל CSCs העכבר למבוגרים לבבות (איור 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
להלן השלבים הקריטיים של הפרוטוקול בידוד CSC. 1) תנאי סטיריליים חייבות להישמר לחילוץ של הלבבות של העכברים. כל זיהום במהלך החילוץ הלב עלול לסכן את איכות CSCs. 2) הדם להסירו לחלוטין לפני הא הלב, אשר נעשה על ידי מספר שוטף של כל הלב והלב חלקים עם HBSS פתרון. 3) החלקים הלב חייב להיות lysed לחלוטין להשעיה תא בו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת, חלקים, המענקים מכוני הבריאות הלאומיים HL-113281 ו- HL116205 כדי פאראס קומאר מישרה.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction – From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
