अलगाव, लक्षण वर्णन, और वयस्क माउस दिल से हृदय स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव
Summary
इस अनुच्छेद के समग्र लक्ष्य के लिए अलगाव, लक्षण वर्णन, और कार्डियक स्टेम सेल (सीएससीएस) के वयस्क माउस दिल से भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल का मानकीकरण है । यहां, हम एक घनत्व ढाल केंद्रापसारक विधि का वर्णन करने के लिए murine सीएससीएस और सीएससी संस्कृति, प्रसार, और cardiomyocytes में भेदभाव के लिए सविस्तार तरीकों को अलग ।
Abstract
रोधगलन (एमआई) दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है । पुनर्जन्म चिकित्सा का एक प्रमुख लक्ष्य एमआई के बाद मृत मायोकार्डियम की भरपाई करना है. हालांकि कई रणनीतियों को पुनर्जीवित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है मायोकार्डियम, स्टेम सेल थेरेपी एक प्रमुख दृष्टिकोण के लिए एक एमआई दिल के मृत मायोकार्डियम भरपाई रहता है । सबूत जमा वयस्क दिल में निवासी कार्डियक स्टेम सेल (सीएससीएस) की उपस्थिति और हृदय पुनर्जनन पर उनके अंत में स्रावी और/या paracrine प्रभाव पता चलता है । हालांकि, सीएससी अलगाव और उनके लक्षण वर्णन और रोधगलन की ओर भेदभाव, विशेष रूप से cardiomyocytes, एक तकनीकी चुनौती बनी हुई है । वर्तमान अध्ययन में, हम अलगाव, लक्षण वर्णन, और वयस्क माउस दिल से सीएससीएस के भेदभाव के लिए एक सरल तरीका प्रदान की है । यहां, हम सीएससीएस, जहां दिल एक ०.२% collagenase द्वितीय समाधान से पचा रहा है के अलगाव के लिए एक घनत्व ढाल विधि का वर्णन । पृथक सीएससीएस की विशेषता के लिए, हम सीएससीएस/कार्डियक मार्करों Sca-1, NKX2-5, और GATA4, और pluripotency/तनों मार्करों OCT4, SOX2, और Nanog की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया है । हम भी उंहें एक पेट्री डिश में संवर्धन और प्रसार मार्कर Ki-६७ की अभिव्यक्ति का आकलन द्वारा पृथक सीएससीएस की प्रसार क्षमता निर्धारित किया है । सीएससीएस की विभेदक क्षमता के मूल्यांकन के लिए हमने सात-दस दिनों तक कल्चरल सीएससीएस का चयन किया. हम उंहें एक cardiomyocyte भेदभाव मध्यम के साथ एक नई थाली में स्थानांतरित कर दिया । वे 12 दिनों के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में मशीन हैं, जबकि भेदभाव मध्यम हर तीन दिनों में बदल जाता है । विभेदित सीएससीएस व्यक्त cardiomyocyte-विशिष्ट मार्कर: actinin और ट्रोपोनिन I. इस प्रकार, सीएससीएस इस प्रोटोकॉल के साथ अलग उपजी और हृदय मार्करों है, और वे cardiomyocyte वंश की ओर प्रसार और भेदभाव के लिए एक संभावित है ।
Introduction
कोरोनरी हृदय रोग, रोधगलन (एमआई) सहित,1दुनिया भर में मौत का एक प्रमुख कारण है । मृत मायोकार्डियम पैदा करने के लिए स्टेम सेल थेरेपी एक मील दिल2,3,4,5के कार्डियक समारोह में सुधार करने के लिए एक प्रमुख दृष्टिकोण रहता है । स्टेम कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के मृत मायोकार्डियम भरपाई और एक मील दिल के कार्डियक समारोह में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । वे मोटे तौर पर भ्रूण स्टेम कोशिकाओं6 और वयस्क स्टेम कोशिकाओं में वर्गीकृत किया जा सकता है । वयस्क स्टेम कोशिकाओं में, स्टेम सेल के विभिंन प्रकार के अस्थि मज्जा-व्युत्पंन mononuclear कोशिकाओं7,8, mesenchymal स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा9,10, वसा ऊतक से व्युत्पंन के रूप में इस्तेमाल किया गया है, 11,12, और नाल कॉर्ड13, और सीएससीएस14,15। स्टेम सेल अंत में स्रावी और/paracrine क्रियाओं के माध्यम से कार्डियक पुनर्जनन को बढ़ावा16, 17,18,19,20कर सकते हैं । हालांकि, स्टेम सेल थेरेपी की एक प्रमुख सीमा स्टेम कोशिकाओं है कि पैदा करना और/या एक विशिष्ट हृदय वंश21,22की ओर अंतर कर सकते है की एक पर्याप्त संख्या प्राप्त है । स्टेम सेल के ऑटोलॉगस और allogenic प्रत्यारोपण स्टेम कोशिका थेरेपी9में एक महत्वपूर्ण चुनौती है । सीएससीएस हृदय पुनर्जनन के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण हो सकता है क्योंकि वे दिल से प्राप्त कर रहे है और वे और अधिक आसानी से गैर कार्डियक स्टेम कोशिकाओं से हृदय वंश में विभेदित किया जा सकता है । इस प्रकार, यह teratoma के जोखिम को कम करता है । इसके अलावा, अंत में स्रावी और paracrine प्रभाव सीएससीएस, जैसे exosomes और miRNAs से व्युत्पंन सीएससीएस, स्टेम कोशिकाओं के अन्य प्रकार की तुलना में अधिक प्रभावी हो सकता है । इस प्रकार, सीएससीएस कार्डियक पुनर्जनन23,24के लिए एक बेहतर विकल्प रहता है ।
हालांकि सीएससीएस एक एमआई दिल में हृदय पुनर्जनन के लिए एक बेहतर उंमीदवार है उनके हृदय की उत्पत्ति के कारण, सीएससीएस के साथ एक प्रमुख सीमा कम एक कुशल अलगाव विधि की कमी के कारण उपज है । एक और सीमा cardiomyocytes वंश2,25,26,27की ओर सीएससीएस के बिगड़ा भेदभाव हो सकता है । इन सीमाओं को दरकिनार, सीएससी अलगाव, लक्षण वर्णन, और हृदय वंश के प्रति भेदभाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । सीएससीएस के लिए कोई एकल स्वीकार्य मार्कर और सीएससीएस पैदावार कम सीएससीएस के एक विशिष्ट कोशिका-सतह मार्कर आधारित अलगाव है । यहां, हम एक सरल ढाल केंद्रापसारक दृष्टिकोण मानकीकरण के लिए माउस दिल से सीएससीएस अलग है कि लागत प्रभावी और सीएससीएस की वृद्धि हुई उपज में परिणाम है । इन पृथक सीएससीएस प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल shorting द्वारा विशिष्ट सेल-सतह मार्कर के लिए चुना जा सकता है । सीएससीएस अलगाव के अलावा, हम सीएससी संस्कृति, लक्षण वर्णन, और cardiomyocyte वंश के प्रति भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की है । इस प्रकार, हम एक सुरुचिपूर्ण विधि को अलग करने के लिए वर्तमान, विशेषताएं, संस्कृति, और वयस्क माउस दिल से सीएससीएस अंतर (चित्रा 5) ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस सीएससी आइसोलेशन प्रोटोकॉल के अहम स्टेप्स इस प्रकार हैं । 1) एक निष्फल हालत चूहों से दिलों की निकासी के लिए बनाए रखा जाना चाहिए । दिल निष्कर्षण के दौरान किसी भी संदूषण सीएससीएस की गुणवत्ता से समझौता ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम, भागों में, स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों के द्वारा समर्थित है एचएल-११३२८१ और HL116205 पारस कुमार मिश्र को ।
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
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