分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化
Summary
この記事の全体的な目標は、分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞 (CSCs) の分化のためのプロトコルを標準化することです。ここでは、マウス CSCs を分離する密度勾配遠心法と心筋細胞への分化、増殖、文化 CSC の精緻な方法について述べる。
Abstract
心筋梗塞 (MI) は、罹患率と世界中の死亡の主要な原因です。再生医療の主な目的は、MI 後死んだ心筋を補充するためにです。いくつかの戦略は、心筋を再生する使用されている幹細胞療法まま俺の心死んだ心筋を補充するために主要なアプローチになります。成人の心臓と心筋再生に内分泌やパラクリン効果で居住者心臓幹細胞 (CSCs) の存在を示唆証拠の蓄積します。しかし、CSC 分離特性と特に心筋心筋細胞へ分化技術的課題が残っています。本研究では分離と性質、CSCs の成体マウスの心から差別化の簡単な方法を提供します。ここでは、CSCs、0.2% コラゲナーゼ II ソリューションによって心を消化する場所の隔離のための濃度勾配法について述べる。分離 CSCs を特徴付ける、CSCs/心臓マーカー Sca 1、NKX2-5、および、GATA4 および多能性/未分化マーカー OCT4、SOX2, Nanog の発現を評価しました。シャーレで培養増殖マーカー Ki 67 の式を評価することにより分離 CSCs の拡散可能性も決定。CSCs の微分の潜在性を評価するため、我々 は 7 に 10 日間培養 CSCs を選択しました。我々 は心筋細胞分化培地と新しいプレートにそれらを転送します。彼らは 12 日細胞文化のインキュベーターで培養分化培地は 3 日ごとに変更中。差別化された CSCs エクスプレス心筋細胞特異的マーカー: アクチニンとトロポニン私。したがって、このプロトコルで分離された CSCs ある未分化と心臓マーカー、増殖や心筋細胞系列へ分化する可能性があります。
Introduction
虚血性心臓病、心筋梗塞 (MI) などは世界の1のまわりの死の主要な原因です。死んだ心筋を再生のための幹細胞療法のまま、MI の心2,の3,4、5の心機能を改善するために主要なアプローチです。異なったタイプの幹細胞は、死んだ心筋を補充するために、俺の心の心機能を改善するために使用されています。胚性幹細胞6と成人幹細胞に大きく分類することができます。大人の幹細胞の骨髄由来単核細胞7、8骨髄9,10,脂肪組織由来間葉系幹細胞などさまざまな種類の幹細胞を使用しているされて11,12、および臍帯13、CSCs14,15。幹細胞は、内分泌やパラクリン アクション16,17,18,19,20による心筋再生を昇格できます。しかし、幹細胞療法の主要な制限が増殖したり、特定の心臓系統21,22の方向へ分化する幹細胞の十分な数を取得します。自家および同種幹細胞移植は幹細胞療法9で重要な課題です。CSCs は、中心部から派生しているため、彼らすることができますより簡単に区別する心臓系統に非心臓幹細胞よりも心臓再生のためのより良いアプローチにかもしれない。したがって、奇形のリスクが軽減されます。また、エクソソームなど、CSCs から派生した Mirna CSCs の内分泌とパラクリンの効果は幹細胞の他のタイプよりも効果的かもしれません。従って、CSCs 残る心臓再生23,24のためのより良いオプションです。
CSCs は心臓起源のため MI 心心筋再生に適して、CSCs の主要な制限は効率的な分離方法の不足のため以下の収量。別の制限は、心筋細胞系列2,25,26,27に向かって CSCs の障害者差別化で可能性があります。これらの制限を回避するために CSC の分離、特性評価、心臓系統への分化に効率的なプロトコルを開発することが重要です。CSCs の単一の許容可能なマーカーがない、CSCs の特定細胞表面マーカーに基づく分離が少ない CSCs を得られます。ここでは、費用対効果は、CSCs の増加収量結果マウス心臓から CSCs を分離するための単純な勾配遠心法アプローチを標準化します。これらの孤立した CSCs は、蛍光活性化細胞を短絡すること特定の細胞表面マーカーの選択できます。CSCs の分離に加えて CSC 文化、特性評価、心筋細胞系列への分化にプロトコルを提供します。したがって、分離し、文化を特徴付ける成体マウスの心 (図 5) から CSCs を区別するエレガントな方法を提案する.
Protocol
住宅、麻酔科とマウスの犠牲をネブラスカ大学医療センターの承認された IACUC プロトコルに従って行った。 1. 材料 オスの鼠の動物機関 CSCs。 CSCs を分離するために社内保管することができますも使用 10-12 週齢 c57bl/6 j ブラックは非妊娠したメスマウスから分離されます。 オートクレーブに入れることによって外科はさみ、微細手術用はさみ、湾曲したシ?…
Representative Results
本研究では 10-12 週齢の c57bl/6 j マウス雄心から CSCs を分離しました。ここでは、簡易 CSC 分離と多能性マーカーを用いた評価法を提案しました。また、CSC 分化のエレガントな方法と心筋細胞系統に分化した CSCs の評価を発表しました。(図 1 aと1 b) 位相差顕微鏡下で 2 に 3-日-培養 CSCs の紡錘形形態を観察した.幹細胞になる時間の間?…
Discussion
この CSC の隔離のプロトコルの重要な手順は次のとおりです。1) 滅菌条件は、マウスから心の抽出のために維持されなければなりません。心抽出中に汚染が CSCs。 2 の品質を危険にさらす) ミンチ入りの HBSS ソリューション全体の心と心のいくつかの洗浄によって行われる心の前に血を完全に削除する必要があります。3) 心の部分は、コラゲナーゼの解決と単一細胞懸濁液に完全に分離する必?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、パーツでサポート、HL 113281 とパラス ・ クマール ・ ミシュラに HL116205 国立衛生研究所の助成金によって。
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
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Citer Cet Article
Yadav, S. K., Mishra, P. K. Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart. J. Vis. Exp. (143), e58448, doi:10.3791/58448 (2019).