절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화
Summary
이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.
Abstract
심근 경색 (MI)는 병 적 상태와 사망률 세계 각국의 주요 원인입니다. 재생 의학의 주요 목표는 미 후 죽은 심근을 보충. 여러 전략 심근을 다시 생성 하는 이용 되었다, 줄기 세포 치료는 내 심장의 죽은 심근을 보충 하는 주요 접근 남아 있다. 증거를 축적 성인 심장 및 심장 재생, paracrine 또는 내 분 비 효과에서 주민 심장 줄기 세포 (CSCs)의 존재를 제안 합니다. 그러나, CSC 절연 특성 및 심근 세포, 특히 cardiomyocytes 향해 차별화 기술 도전 남아 있습니다. 현재 연구에서 우리는 절연, 특성, 및 성인 마우스 마음에서 CSCs의 차별화에 대 한 간단한 방법을 제공. 여기, CSCs, 심장 0.2% 콜라 II 솔루션에 의해 소화 된다의 절연에 대 한 밀도 그라데이션 방법을 설명 합니다. 격리 CSCs 특성, 우리는 Sca 1, NKX2-5, 및 GATA4, CSCs/심장 마커 및 pluripotency/stemness 마커 OCT4, SOX2, 및 Nanog 식 평가. 우리는 또한 배양 접시에 배양 하 고 확산 표식 기-67의 식을 평가 하 여 절연된 CSCs의 확산 가능성을 결정. CSCs의 감 별 법 잠재력을 평가, 우리는 7-10 일 교양 CSCs 선택. 우리는 cardiomyocyte 차별화 매체와 새로운 접시에 그들을 전송. 그들은 셀 문화 인큐베이터에서 12 일 동안 incubated는 차별화 매체는 3 일 마다 변경 하는 동안. 차별화 된 CSCs 익스프레스 cardiomyocyte 특정 마커: actinin와 분 나. 따라서,이 프로토콜 절연 CSCs stemness 있고 심장 마커, 그리고 그들은 확산 및 cardiomyocyte 혈통으로 차별화에 대 한 가능성.
Introduction
허 혈 성 심장 질환, 심근 경색 (MI)를 포함 하 여 세계1주위 죽음의 주요 원인입니다. 죽은 심근 재생을 위한 줄기 세포 치료는 미 심장2,3,,45의 심장 기능을 개선 하는 주요 접근 남아 있다. 다른 종류의 줄기 세포 죽은 심근을 보충 하 고는 내 심장의 심장 기능을 개선 하기 위해 사용 되었습니다. 그들은 광범위 하 게 배아 줄기 세포6 및 성인 줄기 세포로 분류 될 수 있습니다. 성인 줄기 세포에서 다양 한 종류의 줄기 세포 사용 되었습니다, 단 세포 골 수에서 파생 된7,8, 골9,10, 지방 조직 에서에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 등 11,12및 탯13, CSCs14,15. 줄기 세포 심장 재생 paracrine 또는 내 분 비 작업16,17,18,,1920를 통해 홍보할 수 있습니다. 그러나, 줄기 세포 치료의 주요 한계 확산 수 있는 특정 심장 혈통21,22향해 분화 줄기 세포의 적절 한 번호를 얻는 이다. 헌 및 allogenic 이식 줄기 세포의 줄기 세포 치료9에 있는 중요 한 도전 이다. 그들은 마음에서 파생 하기 때문에 그들은 분화 될 수 있다 더 쉽게 심장 계보에 비 심장 줄기 세포 보다 CSCs 심장 재생을 위한 더 나은 방법은 수 있습니다. 따라서, 기형종의 위험을 줄여줍니다. 또한, 내 분 비 및 paracrine 효과 CSCs의 exosomes 등 miRNAs는 CSCs에서 파생 된 줄기 세포의 다른 유형 보다 더 효과적인 수 있습니다. 따라서, CSCs는 심장 재생23,24에 대 한 더 나은 옵션을 남아 있다.
CSCs는 그들의 심장 근원 때문에 미 마음에 심장 재생을 위한 더 나은 후보자, CSCs는 주요 한계는 효율적인 절연 방법의 부족으로 인해 더 적은 수확량. 또 다른 한계는 cardiomyocytes 리니지2,25,,2627향해 CSCs의 장애인된 차별 될 수 있습니다. 이러한 한계를 회피, CSC, 특성화, 고립과 심장 혈통으로 차별화에 대 한 효율적인 프로토콜을 개발 하는 것 중요 하다. CSCs에 대 한 단일 허용 마커 없는 고는 특정 세포 표면 마커 기반 격리 CSCs의 적은 CSCs 수익률. 여기, 우리는 비용 효율적 이며 CSCs의 증가 수확량에서 결과 마우스 심장 CSCs 격리 하기 위해 간단한 그라데이션 원심 접근 표준화. 이러한 격리 CSCs 형광 활성화 셀 단락에 의해 특정 세포 표면 표식에 대 한 선택할 수 있습니다. CSCs 격리, 뿐만 아니라 우리는 CSC, 특성화, 문화와 cardiomyocyte 혈통으로 차별화에 대 한 프로토콜을 제공 했습니다. 따라서, 우리는 격리, 성격, 문화, CSCs 성인 마우스 마음 (그림 5)에서 분화 하는 우아한 방법 제시.
Protocol
주택, 마 취, 그리고 마우스의 희생은 네브라스카 대학 의료 센터의 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 하는 것을 수행 했다. 1입니다. 자료 사용 10-에 12 주 된 C57BL/6J 블랙 남성 쥐, CSCs CSCs의 격리에 대 한 제도적 동물 시설에서 사내 보관 수도 비 임신 여성 쥐에서 격리 되어야. 모든 필요한 수술 악기, 수술가 위, 등 정밀한 수술가 위, 곡선된 칼 집게, 외과 블레이드, ?…
Representative Results
현재 연구에서 우리는 10 월에 12 주 된 C57BL/6J 남성 쥐 마음에서 CSCs 고립. 여기, 우리는 CSC 격리 및 pluripotency의 마커를 사용 하 여 특성을 위한 간단한 방법을 제시 했습니다. 우리는 또한 CSC 차별화 우아한 메서드와 CSCs cardiomyocytes 혈통으로 분화의 특성을 제시. 2-하 3-일-교양 CSCs (그림 1A 및 1B) 단계 대조 현미경의 스핀 들 모양 형태를 관?…
Discussion
이 CSC 격리 프로토콜의 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 1) 멸 균된 조건이 생쥐에서 심 혼의 추출에 대 한 유지 되어야 합니다. 심장 추출 하는 동안 어떤 오염 든 지 CSCs. 2의 품질을 손상 수 있습니다) 혈액 조각 HBSS 솔루션 전체 마음과 심장의 여러 가지 세척에 의해 이루어집니다 마음을 닦지 하기 전에 완전히 제거 해야 합니다. 3) 심장 조각은 콜라 솔루션으로 단일 셀 서 스 펜 션으로 완전히 ly…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에서에서 지원 됩니다, 부품, HL-113281 및 HL116205 성명서 쿠마 Mishra에 건강의 국가 학회 교부 금에 의해.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction – From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
Citer Cet Article
Yadav, S. K., Mishra, P. K. Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart. J. Vis. Exp. (143), e58448, doi:10.3791/58448 (2019).