Aislamiento, caracterización y diferenciación de células cardiacas desde el corazón de ratón adulto
Summary
El objetivo general de este artículo es estandarizar el protocolo para el aislamiento, caracterización y diferenciación de células madre cardiacas (CSCs) desde el corazón de ratón adulto. Aquí, describimos un método de centrifugación del gradiente de densidad para aislar las CMC murinas y métodos elaborados por la cultura, la proliferación y la diferenciación en cardiomiocitos de CSC.
Abstract
Infarto de miocardio (IM) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo. Una meta importante de la medicina regenerativa es reponer el miocardio muerto después de MI. Aunque se han utilizado varias estrategias para regenerar el miocardio, terapia de células madre sigue siendo un enfoque importante para reponer el miocardio muerto de un corazón de MI. La acumulación de pruebas sugiere la presencia de células cardíacas residentes (CSCs) en el corazón de adultos y sus efectos endocrinos o paracrinos en la regeneración cardiaca. Sin embargo, aislamiento de CSC y su caracterización y diferenciación hacia células del miocardio, especialmente cardiomiocitos, sigue siendo un desafío técnico. En el presente estudio, nos proporciona un método simple para el aislamiento, caracterización y diferenciación de las CMC desde el corazón de ratón adulto. Aquí, describimos un método de gradiente de densidad para aislamiento de CSC, donde se digiere el corazón por una solución de 0,2% colagenasa II. Para caracterizar las CSCs aislados, se evaluó la expresión de marcadores de CSCs cardíaca Sca-1, NKX2-5 y GATA4 y marcadores de pluripotencia/troncalidad OCT4, SOX2 y Nanog. También determinamos el potencial de proliferación de las CMC aislados por cultivo en una placa de Petri y la evaluación de la expresión del marcador de proliferación Ki-67. Para evaluar el potencial de diferenciación de las CMC, se seleccionaron siete a diez días cultivadas CSCs. Nos trasladaron a una nueva placa con un medio de diferenciación de cardiomiocitos. Se incuban en una incubadora de cultivo celular de 12 días, mientras que el medio de diferenciación se cambia cada tres días. El CSC diferenciada expresa marcadores específicos de cardiomiocitos: actinina y troponina I. Así, CSCs aislados con este protocolo tienen troncalidad y marcadores cardiacos, y tienen un potencial de proliferación y diferenciación hacia linaje de cardiomiocitos.
Introduction
Enfermedad isquémica del corazón, incluyendo infarto de miocardio (IM), es una causa importante de muerte en el mundo1. Terapia de células madre para regenerar el miocardio muerto sigue siendo un enfoque principal para mejorar la función cardiaca de un MI corazón2,3,4,5. Se han utilizado diferentes tipos de células madre para reponer el miocardio muerto y para mejorar la función cardiaca de un corazón de MI. Pueden categorizar ampliamente en células madre embrionarias6 y adulto células de vástago. En las células madre adultas, se han utilizado varios tipos de células, como las células mononucleares de médula ósea7,8, las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea9,10, el tejido adiposo 11,12y13de cordón umbilical y CSC14,15. Las células madre pueden promover la regeneración cardiaca, endocrina o paracrina acciones16,17,18,19,20. Sin embargo, una limitación importante de la terapia de células madre es la obtención de un número suficiente de células madre que pueden proliferar y diferenciarse hacia un linaje cardíaco específico21,22. Trasplantes autólogos y alogénicos de células madre es un reto importante en la terapia de células madre9. CSCs podrían ser un mejor enfoque para la regeneración cardiaca porque proceden del corazón y pueden ser distinguidos más fácilmente en linajes cardíacos que células no cardiacas. Por lo tanto, reduce el riesgo de teratoma. Además, los efectos endocrinos y paracrinos de CSC, como exosomas y miRNAs derivados de la CSC, podrían ser más eficaces que otros tipos de células madre. Así, las CMC sigue siendo una mejor opción para la regeneración cardiaca23,24.
Aunque CSC es un mejor candidato para la regeneración cardiaca en un corazón de MI debido a su origen cardiaco, una limitación importante con CSC es menor rendimiento debido a la falta de un método de aislamiento eficientes. Otra limitación puede ser la diferenciación deteriorada de CSCs hacia cardiomiocitos linaje2,25,26,27. Para evitar estas limitaciones, es importante desarrollar un protocolo eficiente para el aislamiento, caracterización y diferenciación hacia linaje cardíaco de CSC. No hay ningún marcador aceptable solo para CSC y un aislamiento de basado en el marcador de superficie celular específico de CSCs rinde menos CSCs. Aquí, nos estandarizar un enfoque simple centrifugación gradiente para aislar CSC desde el corazón de ratón que es rentable y da lugar a un aumento del rendimiento de CSC. Estas CSCs aislados pueden seleccionarse para marcadores de superficie celular específicos cortocircuitando celular activado por fluorescencia. Además de aislamiento de las CMC, proporcionamos un protocolo para cultura de CSC, caracterización y diferenciación hacia linaje de cardiomiocitos. Así, presentamos un elegante método para aislar, caracterizar, cultura y distinguir las CMC de corazones de ratón adulto (figura 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos de este protocolo de aislamiento de CSC son las siguientes. 1) una condición esterilizada debe mantenerse para la extracción de los corazones de los ratones. Cualquier contaminación durante la extracción del corazón puede comprometer la calidad de la CSC. 2) la sangre debe eliminarse completamente antes de picar el corazón, que se realiza por varios lavados de todo corazón y el corazón pedazos con solución HBSS. 3) las piezas de corazón deben lisis totalmente en una suspensión unicelular co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado, en parte, por las institutos nacionales de salud subvenciones HL-113281 HL116205 a Paras Kumar Mishra.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
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