Isolement, caractérisation et différenciation des cellules souches cardiaques du coeur de souris adulte
Summary
L’objectif général du présent article est de normaliser le protocole pour l’isolement, caractérisation et différenciation des cellules souches cardiaques (CSCs) du coeur de souris adulte. Nous décrivons ici une méthode de centrifugation en gradient de densité d’isoler CCS murins et les méthodes élaborées pour la culture, la prolifération et la différenciation dans les cardiomyocytes CSC.
Abstract
Infarctus du myocarde (im) est des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Un objectif majeur de la médecine régénérative est de reconstituer le myocarde mort après MI. Bien que plusieurs stratégies ont été utilisées pour régénérer le myocarde, la thérapie de cellules souches reste une approche importante pour reconstituer le myocarde mort d’un cœur de MI. Accumuler des preuves suggère la présence de résidents des cellules souches cardiaques (CSCs) au coeur adult et leurs effets endocriniens et/ou paracrine sur la régénération cardiaque. Isolement de CSC et leur caractérisation et différentiation vers des cellules myocardiques, surtout les cardiomyocytes, reste toutefois un défi technique. Dans la présente étude, nous avons fourni une méthode simple pour l’isolation, la caractérisation et la différenciation des CSC du coeur de souris adulte. Nous décrivons ici une méthode de gradient de densité pour l’isolement des CSC, où le cœur est digéré par une solution II de collagénase de 0,2 %. Afin de caractériser les CCF isolés, nous avons évalué l’expression des marqueurs de la CCS/cardiaque Sca-1, NKX2-5 et GATA4 et marqueurs pluripotence/stemness OCT4, SOX2 et Nanog. Nous avons également déterminé le potentiel de prolifération des CSC isolées en les cultivant dans une boîte de Pétri et en évaluant l’expression du marqueur de prolifération Ki-67. Pour évaluer le potentiel de différenciation des CSC, nous avons sélectionné sept à dix jours cultivées CSCs. Nous transférés à une nouvelle plaque avec un moyen de différenciation du cardiomyocyte. Ils sont incubés dans un incubateur de culture cellulaire pendant 12 jours, alors que le milieu de différenciation est changé tous les trois jours. Les CCF différenciées expriment marqueurs spécifiques des myocytes cardiaques : actinine et la troponine I. Ainsi, CSCs isolés avec ce protocole ont stemness et marqueurs cardiaques, et ils ont un potentiel de prolifération et de différenciation vers la lignée cardiomyocyte.
Introduction
Maladie cardiaque ischémique, y compris des infarctus du myocarde (im), est une cause majeure de décès dans le monde1. Thérapie de cellules souches pour régénérer le myocarde mort reste une approche importante pour améliorer la fonction cardiaque de MI coeur2,3,4,5. Différents types de cellules souches ont servi à reconstituer le myocarde mort et d’améliorer la fonction cardiaque d’un cœur de MI. Ils peuvent être classés sur les cellules souches6 et adulte des cellules souches embryonnaires. Dans les cellules souches adultes, divers types de cellules souches ont été utilisées, comme la moelle osseuse des cellules mononucléaires7,8, des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse9,10, tissu adipeux 11,12et du cordon ombilical13et CSC14,15. Les cellules souches peuvent promouvoir la régénération cardiaque par système endocrinien et/ou paracrine actions16,17,18,19,20. Toutefois, une limitation majeure de la thérapie de cellules souches est d’obtenir un nombre suffisant de cellules souches qui peuvent proliférer et/ou différencier vers une lignée cardiaque spécifique21,22. Transplantation autologue et l’allogreffe de cellules souches est un défi important dans la thérapie de cellules souches9. CCS pourraient être une meilleure approche pour la régénération cardiaque parce qu’ils proviennent du fond du cœur, et ils peuvent être plus facilement différenciés en lignées cardiaques que les cellules souches non cardiaque. Ainsi, il réduit le risque de tératome. En outre, les effets endocriniens et paracrine des CSC, tels que les exosomes et miARN dérivés des CSC, pourraient être plus efficaces que les autres types de cellules souches. Par conséquent, le CSCs reste une meilleure option pour la régénération cardiaque23,24.
Bien que les CCM est un meilleur candidat pour la régénération cardiaque dans un cœur de MI en raison de leur origine cardiaque, une limitation majeure avec ccs est moins rendement en raison de l’absence d’une méthode d’isolation efficace. Une autre limitation pourrait être la différenciation altérée des CCS vers cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Pour contourner ces limitations, il est important de développer un protocole efficace pour CSC isolement, caractérisation et différenciation vers la lignée cardiaque. Il n’y a aucun marqueur unique acceptable pour CCM et un isolement d’axée sur le marqueur de surface cellulaire spécifique des CCS des rendements moins CCS. Ici, nous normaliser une approche simple centrifugation en gradient pour isoler CCS du coeur de souris qui est rentable et se traduit par un rendement accru des CSC. Ces CCF isolés peut être sélectionnés pour des marqueurs spécifiques de la surface cellulaire par fluorescence-lancée de cellules mise en court-circuit. En plus de l’isolement de CSC, nous avons fourni un protocole CSC culture, caractérisation, et différenciation vers cardiomyocyte lignée. Ainsi, nous présentons une méthode élégante pour isoler, de caractériser, culture et de différencier les CCS de coeurs souris adulte (Figure 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Voici les étapes critiques du présent protocole d’isolement de CSC. 1) une condition stérilisée doit être maintenue pour l’extraction des cœurs des souris. Toute contamination lors de l’extraction du coeur peut compromettre la qualité du CSCs. 2) le sang doit être complètement retiré avant de broyer le cœur, qui est effectué par plusieurs lavages de tout le cœur et le cœur des pièces avec solution HBSS. 3) les morceaux de coeur doivent être complètement lysées dans une suspension de cellules indiv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu, dans certaines régions, par les subventions des National Institutes of Health HL-113281 et HL116205 à par Kumar Mishra.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
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