Microdialyse d’acides aminés excitateurs durant les enregistrements EEG en se déplaçant librement des Rats

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour en vivo microdialyse analyser le communiqué de l’aspartate et du glutamate dans l’hippocampe ventral de rats épileptiques et non-épilepsie, en combinaison avec des enregistrements EEG. Les concentrations extracellulaires de l’aspartate et le glutamate peuvent être corrélées avec les différentes phases de la maladie.

Abstract

Microdialyse est une technique bien établie neuroscience qui met en corrélation les changements de neurologiquement actives substances diffusant dans l’espace interstitiel du cerveau avec le comportement et/ou des résultats spécifiques d’une pathologie (par exemple, saisies pour l’épilepsie). Lors de l’étude de l’épilepsie, la technique de la microdialyse est souvent associée à court terme ou même à long terme vidéo-électroencéphalographie (EEG suivi afin d’évaluer la fréquence des crises spontanées, de gravité, de progression et de regroupement). La microdialyse-EEG combiné repose sur l’utilisation de plusieurs méthodes et instruments. Ici, nous avons réalisé en vivo microdialyse et continue vidéo-EEG, enregistrement de moniteur glutamate et aspartate l’écoulement au fil du temps, dans les différentes phases de l’histoire naturelle de l’épilepsie dans un modèle de rat. Cette approche combinée permet l’appariement des changements dans la libération des neurotransmetteurs, avec des étapes spécifiques de l’évolution de la maladie et la progression. La concentration d’acides aminés dans le dialysat est déterminée par chromatographie liquide. Nous décrivons ici les méthodes et les grandes lignes les principales mesures de précaution un devraient prendre pendant en vivo microdialyse-EEG, avec une attention particulière à la chirurgie stéréotaxique, stimulation basale et élevé de potassium au cours de la microdialyse, profondeur enregistrement de l’électrode EEG et analyse de chromatographie liquide à haute performance de l’aspartate et du glutamate dans le dialysat. Cette approche peut être adaptée pour tester une variété de médicaments ou d’une maladie induite par les changements des concentrations physiologiques de l’aspartate et du glutamate dans le cerveau. Selon la disponibilité d’un test analytique approprié, il peut servir de plus pour tester différentes molécules solubles lorsque vous employez des enregistrement EEG en même temps.

Introduction

Pour donner un aperçu de la déficience fonctionnelle d’induite par le glutamate excitateur et la neurotransmission inhibitrice GABAergique, ayant pour résultat des saisies spontanées dans l’épilepsie du lobe temporal (TLE), nous avons systématiquement suivi des concentrations extracellulaires de GABA¹ et plus tard les niveaux de glutamate et l’aspartate² par microdialyse dans l’hippocampe ventral de rats à divers moments de la maladie naturelle du cours, c’est-à-dirependant le développement et la progression de l’épilepsie. Nous avons profité du modèle TLE, pilocarpine chez les rats, qui imite la maladie très précisément en termes de changements comportementaux, électrophysiologique et histopathologiques^3,4 et nous avons une corrélation entre la concentration dialyse aminés acides à ses différentes phases : la phase aiguë après l’insulte épileptogène, la phase de latence, le temps de la première saisie spontanée et la chronique phass^5,6,7. Encadrant les phases de la maladie a été activée par la surveillance à long terme de vidéo-EEG et l’EEG précis et caractérisation clinique des crises spontanées. Application de la technique de la microdialyse associées au contrôle de vidéo-EEG à long terme nous a permis de proposer des hypothèses mécanistiques de neuropathologie TLE. En résumé, la technique décrite dans ce manuscrit permet l’appariement des altérations neurochimiques dans une zone du cerveau définie avec le développement et la progression de l’épilepsie chez un modèle animal.

Couplés, constituées d’une électrode de profondeur juxtaposée à une canule microdialyse, sont souvent employés dans des études de recherche de l’épilepsie où les changements dans les neurotransmetteurs, métabolites ou des substrats énergétiques doivent être corrélée à l’activité neuronale. Dans la grande majorité des cas, il est utilisé en comportement librement les animaux, mais il peut être également effectuée d’une manière similaire à des êtres humains, par exemple, chez des patients épileptiques pharmaco-résistante, objet d’une enquête d’électrode profondeur avant la chirurgie,⁸. Les enregistrement EEG et dialyse collection peuvent être effectués séparément (par exemple, l’implantation de l’électrode dans un hémisphère et la microdialyse sonde dans l’autre hémisphère ou même effectuer la microdialyse dans un groupe d’animaux lors de l’exécution l’EEG seule dans un autre groupe d’animaux). Toutefois, les électrodes de couplage aux sondes peut présenter des avantages multiples : il simplifie la chirurgie stéréotaxique, limite les dommages aux tissus d’un seul hémisphère (tout en laissant l’autre, intact, comme un contrôle pour des études histologiques) et homogénéiser les résultats que ces proviennent de la même région du cerveau et le même animal.

En revanche, la préparation de l’appareil de sonde-électrode microdialyse couplés exige des compétences et le temps si c’est fait maison. On pourrait passer des quantités relativement élevées d’argent si acheté sur le marché. En outre, quand des sondes microdialyse (pointes de test sont généralement de 200 à 400 µm de diamètre et de 7 à 12 mm de long)⁹et des électrodes EEG (extrémités des électrodes sont généralement de 300 à 500 µm de diamètre et assez longtemps pour atteindre la structure du cerveau d’intérêt¹⁰) sont couplé, cet appareil monté représente un objet relativement lourd et encombrant sur un côté de la tête, ce qui est gênant pour les animaux et sujette à être perdu surtout quand il est connecté à la pompe de dialyse et le système d’enregistrement EEG fil dur. Cet aspect est plus pertinent chez les animaux épileptiques qui sont difficiles à manipuler et moins adaptative pour les sessions de microdialysis. Les techniques chirurgicales adéquates et des soins postopératoires appropriés peuvent entraîner des implants de longue durée qui incommode animaux minime et devraient être poursuivis pour des expériences de combinatoire microdialyse-EEG^{10,11, 12}.

Les avantages et les limites de la technique de la microdialyse ont été examinées en détail par de nombreux chercheurs en neurosciences. Son principal avantage sur les autres en vivo perfusion techniques (p. ex., débit rapide push pull ou perfusion corticale coupe) est un petit diamètre de la sonde qui couvre une superficie relativement précise des intérêts^{13,14, 15}. Deuxièmement, la membrane de la microdialyse crée une barrière physique entre le tissu et le perfusat ; par conséquent, les substances de poids moléculaire élevé ne se croisent pas et n’interfèrent pas avec l’analyse^16,17. En outre, le tissu est protégé contre l’écoulement turbulent du perfusat¹⁸. Un autre avantage important est la possibilité de modifier le flux du perfusat pour maximiser la concentration de l’analyte dans le perfusat (c’est-à-dire, le processus de microdialyse peut être bien défini mathématiquement et peuvent être modifié pour le rendement élevé concentration de l’analyte dans l’échantillon)¹⁹. Enfin, la technique peut servir pour infuser les drogues ou les substances pharmacologiquement actives dans les tissus d’intérêt et de déterminer leur effet sur le site de l’intervention²⁰. En revanche, microdialyse a un temps de résolution limitée (généralement plus de 1 min à cause du temps nécessaire pour le prélèvement d’échantillons) par rapport aux capteurs électrochimiques ou biologiques ; C’est une technique invasive qui provoque des lésions tissulaires ; elle compromet l’équilibre neurochimique au sein de l’espace autour de la membrane en raison du gradient de concentration continue de toutes les substances solubles qui pénètre dans le milieu de perfusion avec l’analyte d’intérêt. Enfin, la technique de la microdialyse est fortement influencée par les limites des techniques analytiques utilisées pour la quantification des rejets de substances dans le milieu de perfusion^9,21,22,23 . La chromatographie liquide haute performance (HPLC) après que dérivatisation avec orthophthaldialdehyde pour l’analyse de glutamate et l’aspartate dans des échantillons biologiques a été bien validé^{24,25,26 , 27} et sa discussion approfondie est hors de la portée de ce manuscrit, mais les données produites à l’aide de cette méthode seront décrite en détail.

Lorsqu’effectué correctement et sans modification de la composition du perfusat, microdialyse peut fournir des informations fiables sur les taux de base de la libération des neurotransmetteurs. La plus grande partie des niveaux basales est probablement le résultat de l’effet d’entraînement émetteur du synapses⁹. Car dans bien des cas l’échantillonnage simple du neurotransmetteur dans l’espace synaptique supplémentaire n’est pas suffisant pour poursuivre les objectifs d’une enquête, la microdialyse technique peut être également employée pour stimuler les neurones ou à les priver d’importants ions physiologiques tels que K⁺ ou Ca^{2 +}, afin d’évoquer ou d’empêcher la libération du neurotransmetteur.

Forte stimulation de K⁺ est souvent utilisée en neurobiologie pour stimuler l’activité neuronale non seulement chez les animaux éveillés, mais aussi dans des cultures primaires et organotypique. L’exposition d’un système nerveux sain à des solutions contenant de fortes concentrations de K⁺ (40-100 mM) évoque l’efflux de neurotransmetteurs²⁸. Cette capacité des neurones à fournir une version supplémentaire en réponse à K haute⁺ peut être compromise aux animaux épileptiques¹ et aux autres de^29,de maladies neurodégénératives³⁰. De même, le Ca^{2 +} la privation (obtenue en perfusant les solutions gratuites Ca^{2 +} ) est utilisée pour établir le calcium-dépendante libèrent des neurotransmetteurs plus mesurées par microdialyse. On croit généralement que libération de Ca^{2 +} dépendante est d’origine neuronale, considérant que la libération de Ca^{2 +} indépendante originaire de glia, mais de nombreuses études a soulevé une polémique sur la signification du Ca^{2 +}-mesures sensibles de par exemple glutamate ou GABA⁹: ainsi, si possible, il est conseillé d’appuyer les études microdialyse microcapteur études, car ces derniers ont une résolution spatiale supérieure et les électrodes permet de se rapprocher de synapses³¹.

Concernant microdialysis études chez l’animal épileptique, il est important de souligner que les données obtenues de la plupart d’entre eux comptent sur la surveillance vidéo ou vidéo-EEG des saisies, c’est-à-direde la présence transitoire des signes et/ou symptômes anormaux excessive ou synchrone l’activité neuronale dans le cerveau³². Il y a quelques détails d’électrographiques saisies chez les animaux traité de pilocarpine qui devraient être examiné lors de la préparation de l’expérience. Les crises spontanées sont suivis d’activité déprimée avec fréquentes EEG intercritiques pointes³ et se produisent dans les clusters^33,34. Sham opéré non-épilepsie animaux peut-être présenter des activité de saisie type³⁵ et donc les paramètres pour l’évaluation des enregistrements EEG devraient être normalisés³⁶ et, si possible, le calendrier des sessions de la microdialyse doit être bien défini. Enfin, nous recommandons fortement conformément aux principes et normes méthodologiques pour la surveillance de vidéo-EEG chez les rongeurs adultes de contrôle décrits par les experts de la Ligue internationale contre l’épilepsie et l’American Epilepsy Society dans leurs rapports très récents^{37 ,},³⁸.

Nous décrivons ici la microdialyse du glutamate et aspartate en parallèle avec les enregistrements de vidéo-EEG à long terme chez les animaux épileptiques et leur analyse dans le dialysat par HPLC. On mettra l’accent sur les étapes critiques du protocole qu’on devrait prendre soin de, pour un meilleur résultat.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par l’Université de Ferrare animalier institutionnel et Comité d’urbanisme et par le ministère italien de la santé (autorisation : D.M. 246/2012-B) conformément aux lignes directrices énoncées dans les communautés européennes Directive du Conseil du 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Ce protocole est réglé spécifiquement pour la détermination de glutamate et l’aspartate dans dialysats de cerveau de rat obtenus dans le cadre de contrôle de l’EE…

Representative Results

Récupération de la sonde Le recouvrement moyen (c.-à-d., la teneur moyenne des acides aminés dans le perfusat sous forme de pourcentage du contenu dans un volume égal de solution flacon) était 15,49 ± 0,42 % à un débit de 2 μL/min et 6,32 ± 0.64 à 3 μL/min pour le glutamate et 14,89 ± 0,36 % à un débit de 2 ΜL/min et 10.13 ± 0,51 à 3 μL/min pour l’aspartate lors de l’utilisation de la sonde de memb…

Discussion

Dans ce travail, nous montrons comment un enregistrement continu de la vidéo-EEG couplé avec la microdialyse peut être effectué dans un modèle expérimental d’ELT. Techniques d’enregistrement de vidéo-EEG sont utilisés pour diagnostiquer correctement les différentes phases de la progression de la maladie chez les animaux et la technique de la microdialyse est utilisée pour décrire les changements dans la libération de glutamate qui se produisent dans le temps (aucuns changements n’ont été trouvés pour…

Materials

3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
guide cannula	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml – tramadol	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	Material
probe clip holder	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml – diazepam	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	Material
1 mL syringe with 25G needle	Vetrotecnica, Padova, Italy	11.3500.05	Material
rat flexible feeding needle 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
digital video surveillance system	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Equipment
microdialysis probe	Agn Tho's, Lindigö Sweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
microdialysis probe	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	Material
block heater	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Equipment
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
infusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
fine bore polythene tubing	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blue tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL syringe with 22G needle	Chemil, Padova, Italy	S02G22	Material
vial cap	Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
glass insert with bottom spring	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	Material
autosampler vial	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit	Knauer, Berlin, Germany	V7602	Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump	Knauer, Berlin, Germany	V7603	Equipment
spectrofluorometric detector	Shimadzu, Kyoto, Japan	RF-551	Equipment
chromatogrphic column	Knauer, Berlin, Germany	25EK181EBJ	Material
chromatogrphic pre-column	Knauer, Berlin, Germany	P5DK181EBJ	Material
mobile phase solution A	0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0		Solution
mobile phase solution B	40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5		Solution
Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modified Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
saline	0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0		Solution
sucrose solution	10% sucrose in distilled water		Solution