आज़ादी से चलती चूहों में ईईजी रिकॉर्डिंग के दौरान उत्तेजक अमीनो अम्ल की Microdialysis
Summary
यहाँ, हम मिरगी रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में मिरगी और गैर ईईजी चूहों के ventral हिप्पोकैम्पस में aspartate और ग्लूटामेट रिहाई का विश्लेषण करने के लिए vivo microdialysis में के लिए एक विधि का वर्णन । aspartate और ग्लूटामेट की Extracellular सांद्रता रोग के विभिंन चरणों से संबंधित हो सकती है ।
Abstract
Microdialysis एक अच्छी तरह से स्थापित तंत्रिका विज्ञान तकनीक है कि स्नायविक सक्रिय व्यवहार के साथ मस्तिष्क मध्यवर्ती अंतरिक्ष में फैलाना पदार्थों के परिवर्तन को संबद्ध है और/या एक विकृति के विशिष्ट परिणाम के साथ (जैसे, बरामदगी मिरगी के लिए) । मिर्गी का अध्ययन करते समय, microdialysis तकनीक अक्सर अल्पकालिक या भी दीर्घकालिक वीडियो-electroencephalography (ईईजी) सहज जब्ती आवृत्ति, गंभीरता, प्रगति और क्लस्टरिंग का आकलन करने के लिए निगरानी के साथ संयुक्त है । संयुक्त microdialysis-ईईजी कई तरीकों और उपकरणों के उपयोग पर आधारित है । यहां, हम vivo microdialysis और निरंतर वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग में प्रदर्शन के लिए समय के साथ ग्लूटामेट और aspartate बहिर्वाह की निगरानी, एक चूहे मॉडल में मिर्गी के प्राकृतिक इतिहास के विभिंन चरणों में । इस संयुक्त दृष्टिकोण रोग के विकास और प्रगति की विशिष्ट चरणों के साथ न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में परिवर्तन के बाँधना की अनुमति देता है. अपोहित में एमिनो एसिड एकाग्रता तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा निर्धारित किया गया था । यहां, हम तरीकों का वर्णन और प्रमुख एहतियाती उपाय एक के दौरान vivo microdialysis-ईईजी में ले जाना चाहिए रूपरेखा, stereotaxic सर्जरी, बेसल और उच्च पोटेशियम उत्तेजना microdialysis, गहराई के दौरान विशेष ध्यान के साथ इलेक्ट्रोड ईईजी रिकॉर्डिंग और अपोहित में aspartate और ग्लूटामेट के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण । इस दृष्टिकोण के लिए दवा या मस्तिष्क में aspartate और ग्लूटामेट की शारीरिक सांद्रता की बीमारी प्रेरित परिवर्तन की एक किस्म का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक उचित विश्लेषणात्मक परख की उपलब्धता पर निर्भर करता है, यह आगे के लिए अलग घुलनशील अणुओं जब एक ही समय में ईईजी रिकॉर्डिंग रोजगार परीक्षण किया जा सकता है ।
Introduction
ग्लूटामेट-मध्यस्थता उत्तेजक और GABAergic निरोधात्मक neurotransmission के कार्यात्मक हानि में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए लौकिक पालि में सहज बरामदगी में जिसके परिणामस्वरूप मिर्गी (TLE), हम व्यवस्थित extracellular सांद्रता की निगरानी गाबा१ और बाद में microdialysis द्वारा ventral हिप्पोकैम्पस में चूहों के विभिन्न समय-बिन्दुओं पर रोग स्वाभाविक पाठयक्रम के दौरान, अर्थात, मिर्गी के विकास और प्रगति के दौरान, ग्लूटामेट तथा aspartate२ के स्तरों पर. हम चूहों में TLE pilocarpine मॉडल का लाभ लिया, जो रोग की नकल बहुत सही व्यवहार के मामले में, electrophysiological और histopathological परिवर्तन3,4 और हम एमिनो के अपोहित एकाग्रता को संबद्ध इसके विभिन्न चरणों के लिए एसिड: तीव्र चरण epileptogenic अपमान के बाद, विलंबता चरण, पहली सहज बरामदगी के समय और जीर्ण phases5,6,7. रोग के चरणों तैयार लंबी अवधि के वीडियो ईईजी निगरानी और सटीक ईईजी और सहज बरामदगी के नैदानिक लक्षण वर्णन द्वारा सक्षम किया गया था । लंबी अवधि के वीडियो-ईईजी मॉनिटरिंग से संबद्ध microdialysis तकनीक के अनुप्रयोग ने हमें TLE neuropathology के लिए यंत्रवत परिकल्पनाओं का प्रस्ताव करने की अनुमति दी । संक्षेप में, इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक एक पशु मॉडल में विकास और मिर्गी की प्रगति के साथ एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर neurochemical परिवर्तन के बाँधना की अनुमति देता है ।
युग्मित उपकरणों, एक microdialysis प्रवेशनी करने के लिए एक गहराई इलेक्ट्रोड झकझोरता से बना है, अक्सर मिर्गी अनुसंधान अध्ययन में कार्यरत हैं, जहां न्यूरोट्रांसमीटर में परिवर्तन, उनके चयापचयों, या ऊर्जा सब्सट्रेट न्यूरॉनल गतिविधि के लिए संबंधित होना चाहिए. मामलों के विशाल बहुमत में, यह स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों में प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह भी मानव में एक समान तरीके से आयोजित किया जा सकता, उदाहरणके लिए, pharmaco प्रतिरोधी मिरगी रोगियों में गहराई इलेक्ट्रोड जांच से पहले सर्जरी के दौर से गुजर रहा है8. दोनों ईईजी रिकॉर्डिंग, और अपोहित संग्रह अलग से किया जा सकता है (जैसे, एक गोलार्द्ध में इलेक्ट्रोड प्रत्यारोप और अन्य गोलार्द्ध में microdialysis जांच या यहां तक कि प्रदर्शन करते हुए पशुओं के एक समूह में microdialysis प्रदर्शन पशुओं के एक अंय समूह में एकमात्र ईईजी) । हालांकि, एक से अधिक लाभ हो सकता है जांच करने के लिए इलेक्ट्रोड युग्मन: यह stereotaxic सर्जरी सरल, केवल एक गोलार्द्ध के लिए ऊतक क्षति को सीमित करता है (जबकि अन्य छोड़, बरकरार, ऊतकवैज्ञानिक अध्ययन के लिए एक नियंत्रण के रूप में), और इन के रूप में परिणाम homogenizes एक ही मस्तिष्क क्षेत्र और एक ही जानवर से प्राप्त कर रहे हैं ।
दूसरी ओर, युग्मित microdialysis जांच की तैयारी-इलेक्ट्रोड डिवाइस कौशल और समय की आवश्यकता है अगर यह घर बनाया है । एक पैसे की अपेक्षाकृत अधिक मात्रा में खर्च अगर बाजार से खरीदा सकता है । इसके अलावा, जब microdialysis जांच (जांच युक्तियां आम तौर पर कर रहे है 200-400 µm व्यास में और 7-12 मिमी लंबी)9, और ईईजी इलेक्ट्रोड (इलेक्ट्रोड युक्तियां आम तौर पर 300-500 µm के व्यास में हैं, और काफी लंबे समय के लिए पर्याप्त ब्याज की मस्तिष्क संरचना तक पहुंचने10) युग्मित डिवाइस सिर के एक तरफ भारी और अपेक्षाकृत बड़ी वस्तु का प्रतिनिधित्व करता है, जो जानवरों के लिए परेशानी है और यह डायलिसिस पंप और हार्ड वायर ईईजी रिकॉर्डिंग प्रणाली से जुड़ा हुआ है, खासकर जब खो जाने की संभावना है । यह पहलू मिरगी जानवरों है कि संभाल करने के लिए मुश्किल है और microdialysis सत्र के लिए कम अनुकूल में अधिक प्रासंगिक है । उचित शल्य चिकित्सा तकनीक और उचित पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल लंबे समय तक चलने प्रत्यारोपण में परिणाम कर सकते हैं कि न्यूनतम पशु असुविधा का कारण है और combinatory microdialysis के लिए पीछा किया जाना चाहिए-ईईजी प्रयोगों10,11, 12.
microdialysis तकनीक के फायदों और सीमाओं की कई neuroscientists द्वारा विस्तार से समीक्षा की गई है । vivo छिड़काव तकनीकों में अंय पर इसका प्राथमिक लाभ (जैसे, तेजी से प्रवाह पुश-पुल या cortical कप छिड़काव) जांच का एक छोटा सा व्यास है जो ब्याज13,14के एक अपेक्षाकृत सटीक क्षेत्र को शामिल किया गया है, 15. दूसरा, microdialysis झिल्ली ऊतक और perfusate के बीच एक शारीरिक बाधा पैदा करता है; इसलिए, उच्च आणविक वजन पदार्थों को पार नहीं करते और विश्लेषण16,17के साथ हस्तक्षेप नहीं करते । इसके अलावा, ऊतक perfusate18के अशांत प्रवाह से सुरक्षित है । एक अंय महत्वपूर्ण लाभ के लिए perfusate में analyte एकाग्रता अधिकतम के लिए perfusate प्रवाह को संशोधित करने की संभावना है (यानी, microdialysis की प्रक्रिया अच्छी तरह से गणितीय परिभाषित किया जा सकता है और उच्च उपज के लिए संशोधित किया जा सकता है नमूने में analyte की सांद्रता)19. अंत में, तकनीक दवाओं या औषधीय सक्रिय पदार्थों को ब्याज के ऊतकों में संचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और20हस्तक्षेप के स्थल पर अपने प्रभाव का निर्धारण । दूसरी ओर, microdialysis एक सीमित संकल्प समय (आमतौर पर अधिक से अधिक 1 मिनट के नमूनों का संग्रह करने के लिए आवश्यक समय के कारण) विद्युत या जैविक सेंसर की तुलना में; यह एक इनवेसिव तकनीक है कि ऊतकों को नुकसान का कारण बनता है; यह सभी घुलनशील पदार्थ है जो ब्याज की analyte के साथ perfusate में प्रवेश के सतत एकाग्रता ढाल के कारण झिल्ली के आसपास अंतरिक्ष के भीतर neurochemical संतुलन समझौता । अंत में, microdialysis तकनीक अत्यधिक विश्लेषणात्मक perfusate9,21,22,23 में पदार्थों के ठहराव के लिए कार्यरत तकनीकों की सीमा से प्रभावित है . जैविक नमूनों में ग्लूटामेट और aspartate विश्लेषण के लिए orthophthaldialdehyde के साथ derivatization के बाद उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) को अच्छी तरह से मान्य किया गया है24,25,26 , २७ और इसकी व्यापक चर्चा इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर है, लेकिन इस विधि का उपयोग कर उत्पादित आंकड़ों को विस्तार से बताया जाएगा ।
जब ठीक से प्रदर्शन किया और perfusate संरचना के संशोधनों के बिना, microdialysis न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई के बेसल स्तर के बारे में विश्वसनीय जानकारी प्रदान कर सकते हैं. बेसल स्तर के सबसे बड़े हिस्से की संभावना synapses9से ट्रांसमीटर spillover का परिणाम है । क्योंकि कई उदाहरणों में न्यूरोट्रांसमीटर के सरल नमूना अतिरिक्त synaptic अंतरिक्ष में एक जांच के लक्ष्यों को आगे बढ़ाने के लिए पर्याप्त नहीं है, microdialysis तकनीक भी न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने के लिए या उन्हें महत्वपूर्ण से वंचित करने के लिए नियोजित किया जा सकता ऐसे K+ या Ca2 +के रूप में शारीरिक आयनों, आदेश आह्वान या न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई को रोकने के लिए.
उच्च K+ उत्तेजना अक्सर तंत्रिका जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है न केवल जाग पशुओं में बल्कि प्राथमिक और organotypic संस्कृतियों में भी न्यूरॉन्स गतिविधि को उत्तेजित करने के लिए. एक स्वस्थ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कश्मीर के उच्च सांद्रता के साथ समाधान के लिए जोखिम+ (40-100 mM) न्यूरोट्रांसमीटर28के समाप्ति उदाहरण देकर । न्यूरॉन्स की यह क्षमता उच्च K+ के जवाब में एक अतिरिक्त रिहाई प्रदान करने के लिए मिरगी जानवरों में समझौता किया जा सकता है1 और अन्य neurodegenerative रोगों में29,30. इसी प्रकार, ca2 + अभाव (perfusing ca द्वारा प्राप्त+ मुक्त समाधान) सबसे न्यूरोट्रांसमीटर microdialysis द्वारा मापा के कैल्शियम निर्भर रिहाई स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह आम तौर पर माना जाता है कि ca2 + निर्भर रिलीज के ंयूरॉन मूल के है, जबकि ca2 + स्वतंत्र रिलीज glia से शुरू होता है, लेकिन कई अध्ययनों से 2 सीए के अर्थ पर विवाद उठाया+-उदाहरण के संवेदनशील माप ग्लूटामेट या गाबा9: इस प्रकार, यदि संभव हो तो, यह microsensor अध्ययन के साथ microdialysis अध्ययन का समर्थन करने के लिए सलाह दी जाती है, के रूप में इन उत्तरार्द्ध उच्च स्थानिक संकल्प किया है और इलेक्ट्रोड synapses के करीब पाने के लिए अनुमति देता है31.
मिरगी पशुओं में microdialysis अध्ययन के बारे में, यह तनाव है कि उनमें से ज्यादातर से प्राप्त डेटा वीडियो या वीडियो पर भरोसा करने के लिए महत्वपूर्ण है-दौरे के ईईजी निगरानी, यानी, लक्षण की क्षणिक घटना और/ ३२मस्तिष्क में अत्यधिक या तुल्यकालिक न्यूरॉन गतिविधि । वहां pilocarpine में electrographic बरामदगी के कुछ विशेष पशुओं का इलाज कर रहे है जो विचार किया जाना चाहिए जब प्रयोग की तैयारी । सहज बरामदगी लगातार ईईजी interictal spikes के साथ उदास गतिविधि के बाद कर रहे हैं3 और३३,३४क्लस्टर में होते हैं । अन्तर्वासना संचालित गैर-मिरगी जानवरों जब्ती की तरह गतिविधि प्रदर्शन कर सकते हैं३५ और इसलिए ईईजी रिकॉर्डिंग मूल्यांकन के लिए मापदंडों३६ मानकीकृत किया जाना चाहिए और, यदि संभव हो तो, microdialysis सत्र के समय अच्छी तरह से परिभाषित किया जाना चाहिए. अंत में, हम अत्यधिक के सिद्धांतों और methodological मानकों के बाद वीडियो-ईईजी निगरानी नियंत्रण वयस्क में मिर्गी और अमेरिकी मिर्गी सोसायटी के खिलाफ अंतरराष्ट्रीय लीग के विशेषज्ञों द्वारा रेखांकित उनके बहुत हाल ही में रिपोर्ट की सिफारिश३७ ,३८.
यहां, हम मिरगी पशुओं में दीर्घकालिक वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग और अपोहित द्वारा HPLC में उनके विश्लेषण के साथ microdialysis ग्लूटामेट और aspartate का वर्णन करते हैं । हम प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम पर जोर देंगे कि एक सबसे अच्छा परिणाम के लिए ध्यान रखना चाहिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, हम बताते है कि कैसे एक सतत वीडियो ईईजी microdialysis के साथ युग्मित रिकॉर्डिंग TLE के एक प्रयोगात्मक मॉडल में प्रदर्शन किया जा सकता है । वीडियो ईईजी रिकॉर्डिंग तकनीक सही ढंग से पशुओं में रोग प्रगति के व…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को वरीयता में प्रकाशित पांडुलिपियों के लिए उनके योगदान के लिए अंना Binaschi, पाओलो Roncon और Eleonora पाल्मा शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।
Materials
| 3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
| Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
| Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
| Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
| Altadol 50 mg/ ml – tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm – gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
| simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
| probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
| Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
| Valium 10 mg/2 ml – diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
| 1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
| rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
| microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
| microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
| block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
| stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
| infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
| fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
| blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
| red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
| 2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
| vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
| septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
| glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
| autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
| spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
| chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
| chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
| mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
| mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
| Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
| sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |
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