Her beskriver vi en metode for i vivo microdialysis å analysere aspartate og glutamat utgivelse ventrale prefiks epileptiske og ikke-epileptiske rotter, i kombinasjon med EEG innspillinger. Ekstracellulære konsentrasjoner av aspartate og glutamat kan være korrelert med de ulike fasene av sykdommen.
Microdialysis er en veletablert nevrovitenskap teknikk som korrelerer endringene av nevrologisk aktive stoffer spre inn i hjernen interstitielle rommet med atferd / med bestemt utfallet av en patologi (f.eks beslag for epilepsi). Når studere epilepsi, er microdialysis teknikken ofte kombinert med kortsiktige eller selv langsiktige video-Elektroencefalogram (EEG overvåking for å vurdere spontan anfall frekvens, alvorlighetsgrad, progresjon og klynger). Kombinert microdialysis-EEG er basert på bruk av flere metoder og instrumenter. Her utført vi i vivo microdialysis og kontinuerlig video-EEG opptak til skjermen glutamat og aspartate ut over tid, i forskjellige faser av den naturlige historien epilepsi i en rotte modell. Dette kombinert tilnærming kan sammenkoblingen av endringer i nevrotransmitter utgivelsen med bestemte stadier av sykdom utvikling og progresjon. Aminosyren konsentrasjonen i den dialysate ble bestemt av flytende kromatografi. Her beskriver vi de metoder og disposisjon de viktigste forholdsregler som bør ta under i vivo microdialysis-EEG, med spesiell oppmerksomhet til stereotaxic kirurgi, basal og høyt kalium stimulering under microdialysis, dybde elektroden EEG innspillingen og høy ytelse flytende kromatografi analyse av aspartate og glutamat i den dialysate. Denne tilnærmingen kan tilpasses til å teste en rekke narkotika eller sykdom induserte endringer i fysiologiske konsentrasjonen av aspartate og glutamat i hjernen. Avhengig av tilgjengelighet av riktig analytisk analysen, kan det videre brukes til å teste forskjellige løselige molekyler når ansette EEG opptak samtidig.
For å gi innsikt i funksjonelle nedskrivning av glutamat-mediert eksitatoriske og GABAergic hemmende neurotransmission resulterer i spontan beslag i tinninglappen epilepsi (TLE), kartlagt vi systematisk ekstracellulære konsentrasjoner av GABA1 og senere nivåene av glutamat og aspartate2 av microdialysis ventrale prefiks rotter på ulike tidspunkt av sykdom naturlig kurs, dvsunder utvikling og progresjon av epilepsi. Vi tok fordel av TLE pilokarpin modellen i rotter, som etterligner sykdommen svært nøyaktig i atferdsmessige, elektrofysiologiske og histopathological3,4 og vi korrelert dialysate konsentrasjonen av aminosyre syrer til sine ulike faser: den akutte fasen etter epileptogenic fornærmelse, ventetid fasen, første spontane beslag og den kroniske phass5,6,7. Innramming sykdom faser ble aktivert av langsiktig EEG video-overvåking og presis EEG og klinisk karakteristikk av spontane beslag. Anvendelse av microdialysis teknikken knyttet til langsiktige EEG video-overvåking tillatt oss å foreslå mekanistisk hypoteser for TLE neuropathology. Oppsummert gir teknikken er beskrevet i dette manuskriptet sammenkoblingen av nevrokjemiske endringer innenfor et definert hjernen med utvikling og progresjon av epilepsi i en dyremodell.
Sammenkoblede enheter, består av en dybde elektrode satt sammen til en microdialysis kanyle, er ofte ansatt i epilepsi forskningsstudier der endringer i nevrotransmittere, metabolitter eller energi underlag bør være korrelert til nevronale aktivitet. I de aller fleste tilfeller, det er brukt i fritt oppføre dyr, men det også kan gjennomføres på en lignende måte i mennesket, f.eksi pharmaco-resistente epileptiske pasienter som gjennomgår dybde elektrode undersøkelse før kirurgi8. Både EEG opptak og dialysate samling kan utføres separat (f.eksimplanting elektroden i en halvkule og microdialysis-sonde i den andre halvkulen eller aften utføre microdialysis i en gruppe dyr ved utføring den eneste EEG i en annen gruppe av dyr). Imidlertid koble elektrodene til sonder kan ha flere fordeler: det forenkler stereotaxic kirurgi, begrenser vevsskade eneste halvkule (samtidig, intakt, som en kontroll for histologiske studier), og homogenizes resultatene som dette er Hentet fra samme hjernen regionen og samme dyret.
På den annen side, krever utarbeidelse av kombinert microdialysis sonde elektrode enheten ferdigheter og tid hvis det er hjemmelaget. En kunne bruke relativt høye mengder penger hvis kjøpt fra markedet. Videre, når microdialysis sonder (sonde tips er vanligvis 200-400 µm i diameter og 7-12 mm store)9og EEG elektroder (elektrode tips er vanligvis på 300-500 µm i diameter, og lenge nok til hjernen strukturen i rundt10) sammen, representerer montert enheten en store og relativt tunge objekt på siden av hodet, som er plagsom for dyr og utsatt for tapt spesielt når den er koblet til dialyse pumpen og hard-wire EEG opptak systemet. Dette aspektet er mer relevant i epileptiske dyr som er vanskelig å håndtere og mindre adaptive til microdialysis økter. Riktig kirurgiske teknikker og riktig postoperativ behandling kan føre til varige implantater som forårsaker minimal dyr ubehag og kompetansesentre for combinatory microdialysis-EEG eksperimenter10,11, 12.
Fordeler og begrensninger av microdialysis teknikken har gjennomgått av mange neuroscientists. Dens primære fordel over andre i vivo perfusjon teknikker (f.eks, skyv / trekk-rask flyt eller kortikale cup perfusjon) er en liten diameter av sonden som dekker et relativt presis området rundt13,14, 15. Andre danner microdialysis membranen en fysisk barriere mellom vev og perfusate; Derfor høy-molekylær vekt stoffer krysse ikke og forstyrrer ikke analyse16,17. Videre er vevet beskyttet mot turbulente flyten av perfusate18. En annen viktig fordel er muligheten til å endre perfusate flyt for å maksimere analytt konsentrasjonen i perfusate (dvs., prosessen med microdialysis kan være godt definert matematisk og kan endres for å gi høy konsentrasjoner av analytt i eksemplet)19. Til slutt, teknikken kan brukes til å sette mot narkotika eller farmakologisk aktive stoffer inn i vevet rundt og bestemme deres effekt på stedet av intervensjon20. På den annen side, har microdialysis en begrenset oppløsning tid (vanligvis mer enn 1 min på grunn av tiden det tar for innsamling av prøver) i forhold til elektrokjemiske eller biologiske sensorer; Det er en invasiv teknikk som forårsaker skade på vev; det kompromisser nevrokjemiske balansen i løpet rundt membranen på grunn av kontinuerlig konsentrasjon gradient av alle vannløselige stoffer som går perfusate med analytt rundt. Til slutt, den microdialysis teknikken er sterkt påvirket av grensene for analytiske teknikker ansatt for kvantifisering av stoffer i det perfusate9,21,22,23 . Høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) når derivatization med orthophthaldialdehyde for glutamat og aspartate analyse i biologiske prøver er også godkjent24,25,26 , 27 og dens omfattende diskusjon er utenfor omfanget av dette manuskriptet, men dataene produsert ved hjelp av denne metoden vil bli beskrevet i detalj.
Når utført riktig og uten modifikasjoner av perfusate sammensetning, kan microdialysis gi pålitelig informasjon om den basale nivået av nevrotransmitter-løslate. Den største delen av den basale nivået er sannsynligvis et resultat av senderen smitteeffekter fra synapser9. Fordi i mange tilfeller enkle prøvetaking av nevrotransmitter inn ekstra synaptic ikke er tilstrekkelig til å forfølge målene for etterforskning, kan microdialysis teknikken benyttes også stimulerer neurons eller frata dem viktig. fysiologiske systemer som K+ eller Ca2 +, for å fremkalle eller hindre at nevrotransmitteren.
Høy K+ stimulering brukes ofte i nevrobiologi for å stimulere neuronal aktivitet ikke bare i våken dyr, men også i primær og organotypic kulturer. Eksponering for en sunn sentralnervesystemet løsninger med høye konsentrasjoner av K+ (40-100 mM) fremkaller middelklasseinnbyggere nevrotransmittere28. Denne evnen av neurons å gi en ekstra utgivelse svar på høy K+ bli skadet i epileptiske dyr1 og andre nevrodegenerative sykdommer29,30. Tilsvarende Ca2 + deprivasjon (fås ved perfusing Ca2 + gratis løsninger) brukes til å opprette kalsium-avhengige utgivelsen av de fleste nevrotransmittere målt ved microdialysis. Det er generelt antatt at Ca2 + avhengige utgivelsen er neuronal opprinnelse, mens Ca2 + uavhengig utgivelse stammer fra glia, men mange studier hevet kontroversen over betydningen av Ca2 +-sensitive målinger av f.eks glutamat eller GABA9: Derfor, hvis mulig, er det tilrådelig å støtte microdialysis studier med microsensor studier som disse sistnevnte har høyere romlig oppløsning og elektrodene kan komme nærmere synapser31.
Når microdialysis studier i epileptiske dyr er det viktig å understreke at dataene innhentet fra de fleste av dem er avhengige av video eller video-EEG overvåking av beslag, i.e.av forbigående forekomsten av tegn og/eller symptomer som skyldes unormal overdreven eller synkron neuronal aktivitet i hjernen32. Det er litt nærmere electrographic beslag i pilokarpin behandlet dyr som bør vurderes når du forbereder eksperimentet. Spontan beslag følges av deprimert aktivitet med hyppige EEG interictal toppene3 og i klynger33,34. Falske styres ikke-epileptiske dyr kan oppføre anfall-lignende aktivitet35 og derfor parameterne for EEG opptak evaluering bør være standardisert36 og hvis mulig, tidspunktet for microdialysis økter skal være godt definert. Til slutt, vi anbefaler følgende prinsipper og metodologiske standarder for video-EEG overvåking kontroll voksen gnagere skissert av eksperter av International League mot epilepsi og amerikanske epilepsi samfunnet i de aller siste rapportene37 ,38.
Her beskriver vi microdialysis av glutamat og aspartate parallelt med langsiktige EEG video-opptakene i epileptiske dyr og analyse i den dialysate av HPLC. Vi vil understreke viktige trinnene av protokollen som man bør ta vare på for best resultat.
I dette arbeidet viser vi hvordan en kontinuerlig EEG video-opptak kombinert med microdialysis kan utføres i en eksperimentell modell av TLE. Video-EEG brenning brukes til å identifisere de ulike fasene av sykdomsprogresjon i dyr og microdialysis teknikken brukes til å beskrive endringene i glutamat utgivelsen som oppstår i tiden (ingen endringer ble funnet for aspartate i en tidligere publisert studie2). Vi anbefaler bruk av en enkelt enhet/implantatet å utføre dem både i hvert dyr av grun…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Anna Binaschi, Paolo Roncon og Eleonora Palma for deres bidrag til manuskripter publisert i prioritet.
3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
Altadol 50 mg/ ml – tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
Valium 10 mg/2 ml – diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |