Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

Summary

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Abstract

Microdialysis é uma técnica bem estabelecida neurociência que correlaciona as alterações de substâncias neurologicamente activas difusão no espaço intersticial do cérebro com o comportamento e/ou com o resultado específico de uma patologia (por exemplo, convulsões para a epilepsia). Ao estudar a epilepsia, a técnica do microdialysis é frequentemente combinada com a curto prazo ou mesmo a longo prazo vídeo-Eletroencefalografia (EEG de monitoramento para avaliar a frequência de apreensão espontânea, severidade, progressão e clustering). O combinado microdialysis-EEG baseia-se na utilização de vários métodos e instrumentos. Aqui, realizamos na vivo microdialysis e contínua de vídeo-EEG gravação ao monitor glutamato e aspartato de vazão ao longo do tempo, em diferentes fases da história natural da epilepsia em um modelo do rato. Esta abordagem combinada permite o emparelhamento das mudanças na versão do neurotransmissor com estágios específicos do desenvolvimento da doença e da progressão. A concentração de aminoácidos do dialisato foi determinada por cromatografia líquida. Aqui, descrevemos os métodos e as principais medidas de precaução devem tomar durante no vivo microdialysis de estrutura de tópicos-EEG, com particular atenção para a cirurgia estereotáxica, estimulação basal e alto de potássio durante microdialysis, profundidade eletrodo de EEG gravação e análise de cromatografia líquida de alta eficiência de aspartato e glutamato no dialisato. Esta abordagem pode ser adaptada testar uma variedade de drogas ou doenças induzidas por alterações das concentrações fisiológicas de aspartato e glutamato no cérebro. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico adequado, pode ser ainda mais usado para testar diferentes moléculas solúveis quando empregando gravação de EEG, ao mesmo tempo.

Introduction

Para fornecer insights sobre o comprometimento funcional da mediada por glutamato excitatório e neurotransmissão inibitória gabaérgica, resultando em convulsões espontâneas em epilepsia do lobo temporal (TLE), nós sistematicamente monitorada concentrações extracelulares de GABA¹ e depois do curso os níveis de glutamato e aspartato² por microdialysis no hipocampo ventral de ratos nos vários pontos de tempo da doença natural, ou seja, durante o desenvolvimento e progressão da epilepsia. Aproveitamos o modelo TLE pilocarpina em ratos, que imita a doença com grande precisão em termos de mudanças comportamentais, eletrofisiológicos e histopatológico^3,4 e nós correlacionada à concentração do fluído de amino ácidos para suas diferentes fases: fase aguda após o insulto eletrofisiolÃ, a fase de latência, o tempo da primeira convulsão espontânea e a crônica phass^5,6,7. Emoldurando as fases da doença foi habilitado pelo acompanhamento a longo prazo de vídeo-EEG e EEG preciso e caracterização clínica de convulsões espontâneas. Aplicação da técnica microdialysis associado com monitoramento de vídeo-EEG a longo prazo permitiu-na propor hipóteses mecanicistas para neuropatologia TLE. Em resumo, a técnica descrita neste manuscrito permite o emparelhamento de alterações neuroquímicas dentro de uma área do cérebro definidos com o desenvolvimento e progressão da epilepsia em um modelo animal.

Dispositivos emparelhados, compostos de um eletrodo de profundidade justaposto a uma microdialysis cânula, muitas vezes são empregados em estudos de investigação de epilepsia onde alterações em neurotransmissores, seus metabólitos ou substratos de energia devem ser correlacionadas com a atividade neuronal. Na maioria dos casos, é utilizado em livremente, comportando-se os animais, mas também pode ser conduzida de forma semelhante em seres humanos, por exemplo, na categoria fármaco-resistente pacientes epilépticos submetidos a investigação de eletrodo de profundidade antes da cirurgia⁸. Gravação de EEG e coleção do fluído podem ser realizada separadamente (por exemplo, implantar o eletrodo em um hemisfério e o microdialysis sonda em outro hemisfério, ou mesmo realizando o microdialysis em um grupo de animais durante a execução o único EEG em outro grupo de animais). No entanto, os eletrodos de acoplamento para sondas pode ter múltiplas vantagens: simplifica a cirurgia estereotáxica, limita o dano tecidual para apenas um hemisfério (enquanto o outro, deixando intacto, como um controle para estudos histológicos) e homogeneiza os resultados como estes são obtidos a partir da mesma região do cérebro e o mesmo animal.

Por outro lado, a preparação do dispositivo acoplado microdialysis sonda-eletrodo requer habilidade e tempo se for feito em casa. Um podia passar quantidades relativamente elevadas de dinheiro se tiver comprado no mercado. Além disso, quando microdialysis sondas (sonda dicas são tipicamente 200-400 µm de diâmetro e 7 a 12 mm de comprimento)⁹e eletrodos de EEG (pontas de eletrodo são geralmente de 300 a 500 µm de diâmetro e o tempo suficiente para alcançar a estrutura cerebral de juros¹⁰) são acoplado, o dispositivo montado representa um objeto relativamente pesado e volumoso, de um lado da cabeça, que é problemático para animais e propenso a ser perdidos, especialmente quando está ligado a bomba de diálise e o sistema de gravação de EEG de arame duro. Este aspecto é mais relevante em animais epilépticos que são difíceis de lidar e menos adaptável para as sessões do microdialysis. Técnicas cirúrgicas adequadas e cuidados pós-operatórios adequados podem resultar em implantes de longa duração que causam desconforto animal mínimo e devem ser perseguidos por combinatória microdialysis-EEG experimentos^{10,11, 12}.

As vantagens e limitações da técnica microdialysis foram examinadas em pormenor pelos muitos neurocientistas. Sua principal vantagem sobre outras na vivo perfusão técnicas (por exemplo, fluxo rápido push-pull ou perfusão cortical Copa) é um pequeno diâmetro da sonda que cobre uma área relativamente precisa de interesse^{13,14, 15}. Em segundo lugar, a membrana do microdialysis cria uma barreira física entre o tecido e o perfusato; Portanto, substâncias de alto peso molecular não cruzar e não interfiram com a análise de^16,17. Além disso, o tecido é protegido contra o fluxo turbulento do perfusato¹⁸. Outra vantagem importante é a possibilidade de modificar o fluxo de perfusato para maximizar a concentração do analito no perfusato (ou seja, o processo de microdialysis pode ser bem definido matematicamente e podem ser modificado para produzir alto concentração do analito na amostra)¹⁹. Finalmente, a técnica pode ser usada para infundir a drogas ou substâncias farmacologicamente activas no tecido de interesse e para determinar o seu efeito no local da intervenção²⁰. Por outro lado, o microdialysis tem um tempo de resolução limitada (normalmente mais de 1 min devido ao tempo necessário para a coleta de amostras) em comparação com sensores eletroquímicos ou biológicos; é uma técnica invasiva que provoca danos nos tecidos; compromete o equilíbrio neuroquímico no espaço ao redor da membrana devido ao gradiente de concentração contínua de todas as substâncias solúveis que entra o perfusato juntamente com o analito de interesse. Finalmente, a técnica do microdialysis é altamente influenciada pelos limites das técnicas analíticas utilizadas para a quantificação de substâncias no perfusato^9,21,22,23 . A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), após derivatização com orthophthaldialdehyde para análise de glutamato e aspartato em amostras biológicas tem sido bem validado^{24,25,26 , 27} e sua extensa discussão está fora do escopo deste manuscrito, mas os dados produzidos por meio desse método serão descritos em detalhes.

Quando realizado corretamente e sem modificações da composição perfusato, microdialysis pode fornecer informações confiáveis sobre os níveis basais de liberação do neurotransmissor. A maior parte dos níveis basais é provavelmente o resultado das repercussões de transmissor de sinapses⁹. Porque em muitos casos a simples amostragem do neurotransmissor no espaço extra sináptico não é suficiente para prosseguir os objectivos de uma investigação, a técnica do microdialysis pode ser empregada também para estimular os neurônios ou privá-los de importante íons fisiológicos como K⁺ ou Ca^{2 +}, de evocar ou evitar a liberação do neurotransmissor.

Alta estimulação K⁺ é usada frequentemente em neurobiologia para estimular a atividade neuronal, não só em animais acordados, mas também em culturas primárias e organotypic. A exposição de um sistema nervoso saudável para soluções com concentrações elevadas de K⁺ (40-100 mM) evoca o efluxo de neurotransmissores²⁸. Essa capacidade dos neurônios para fornecer uma liberação adicional em resposta à alta K⁺ pode ser comprometida em animais epilépticos¹ e em outras de^29,de doenças neurodegenerativas³⁰. Da mesma forma, o Ca^{2 +} privação (obtida por perfusing soluções livres Ca^{2 +} ) é usada para estabelecer o cálcio-dependente liberação de neurotransmissores mais medidos pelo microdialysis. Geralmente acredita-se que a liberação de Ca^{2 +} dependente é de origem neuronal, Considerando que a liberação de Ca^{2 +} independente origina glia, mas muitos estudos levantarem controvérsia sobre o significado de Ca^{2 +}-medições sensíveis de, por exemplo, glutamato ou GABA⁹: assim, se possível, é aconselhável apoiar estudos microdialysis com estudos de microsensor, como estes últimos têm maior resolução espacial e os eletrodos permite para se aproximar de sinapses³¹.

Sobre microdialysis estudos em animais epilépticos, é importante salientar que os dados obtidos da maioria deles dependem de vídeo ou vídeo-EEG, monitoramento de convulsões, ou seja, da ocorrência de sinais e/ou sintomas devido a anormal transitória síncrona ou excessiva atividade neuronal no cérebro³². Existem algumas especificidades de electrographic convulsões em animais de pilocarpina Tratado que devem ser considerados na preparação do experimento. Convulsões espontâneas são seguidas por atividade deprimida com frequentes EEG picos interictais³ e ocorrem em aglomerados^33,34. Sham operados não-epiléptica animais podem apresentar convulsão, como atividade³⁵ e, portanto os parâmetros para avaliação de gravações de EEG devem ser padronizada³⁶ e, se possível, o calendário de sessões do microdialysis deve ser bem definido. Finalmente, é altamente recomendável seguir os princípios e normas metodológicas para monitoramento de vídeo-EEG em roedores adultos controle descrito por peritos da Liga Internacional contra epilepsia e sociedade americana de epilepsia em seus relatórios muito recentes^{37 ,38}.

Aqui, descrevemos microdialysis de glutamato e aspartato em paralelo com as gravações de vídeo-EEG a longo prazo em animais epilépticos e sua análise no dialisato por HPLC. Nós enfatizará os passos críticos do protocolo que um deve cuidar para obter melhores resultados.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Ferrara institucional Animal cuidados e Comissão de uso e pelo Ministério da saúde italiano (autorização: D.M. 246/2012-B) em conformidade com as diretrizes descritas nas Comunidades Europeias Directiva do Conselho, de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo é especificamente ajustado para determinação de aspartato e glutamato no cérebro de rato dialysates obtidas sob controle de EEG do microdialysis sessões em ratos epilépti…

Representative Results

Recuperação de sonda A recuperação média (ou seja, o conteúdo do ácido aminado no perfusato como uma porcentagem do conteúdo em um volume igual de solução frasco) foi 15.49 ± 0,42% a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min e 6.32 ± 0,64 a 3 µ l/min por glutamato e 14.89 ± 0,36% a uma taxa de fluxo de 2 µ L/min e 10.13 ± 0,51 em 3 µ l/min para aspartato ao usar a sonda de membrana cuprophane. Se usar a sonda de me…

Discussion

Neste trabalho, mostramos como uma gravação de vídeo-EEG contínua juntamente com microdialysis pode ser executada em um modelo experimental de TLE. Técnicas de gravação de vídeo-EEG são usadas para diagnosticar corretamente as diferentes fases da progressão da doença em animais e a técnica do microdialysis é usada para descrever as alterações na liberação de glutamato que ocorrem no tempo (sem alterações foram encontradas para aspartato em um estudo publicado anteriormente²). Re…

Materials

3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
guide cannula	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml – tramadol	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	Material
probe clip holder	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml – diazepam	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	Material
1 mL syringe with 25G needle	Vetrotecnica, Padova, Italy	11.3500.05	Material
rat flexible feeding needle 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
digital video surveillance system	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Equipment
microdialysis probe	Agn Tho's, Lindigö Sweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
microdialysis probe	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	Material
block heater	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Equipment
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
infusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
fine bore polythene tubing	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blue tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL syringe with 22G needle	Chemil, Padova, Italy	S02G22	Material
vial cap	Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
glass insert with bottom spring	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	Material
autosampler vial	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit	Knauer, Berlin, Germany	V7602	Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump	Knauer, Berlin, Germany	V7603	Equipment
spectrofluorometric detector	Shimadzu, Kyoto, Japan	RF-551	Equipment
chromatogrphic column	Knauer, Berlin, Germany	25EK181EBJ	Material
chromatogrphic pre-column	Knauer, Berlin, Germany	P5DK181EBJ	Material
mobile phase solution A	0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0		Solution
mobile phase solution B	40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5		Solution
Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modified Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
saline	0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0		Solution
sucrose solution	10% sucrose in distilled water		Solution