Nous présentons notre protocole pour produire induit progéniteurs érythroïdes (PFE) de fibroblastes adultes de souris à l’aide axée sur le facteur de transcription directement lignée reprogrammation (DLR).
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Article de méthode
Diriger la lignée reprogrammation de fibroblastes de souris adulte de progéniteurs érythroïdes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Différenciation et l’engagement de cellules érythroïdes procèdent grâce à l’activation d’un réseau transcriptionnel restreints lignée orchestrée par un groupe du sort de la cellule déterminant et facteurs de maturation. Nous avons précédemment énoncés pour définir l’ensemble minimal des facteurs nécessaires pour instruire les globules rouges de développement à l’aide de lignée directe reprogrammation des fibroblastes en progéniteurs/précurseurs érythroïdes induite (PFE). Nous avons montré que la surexpression de Gata1, Tal1 Lmo2et c-Myc (GTLM) peuvent rapidement convertir murins et humains fibroblastes directement aux PFE qui ressemblent à des cellules érythroïdes bona fide en termes de morphologie, phénotype, et l’expression des gènes. Nous avons l’intention que les PEI fournira un outil précieux pour étudier l’érythropoïèse et cellule de régulation sort. Nous décrivons ici le processus progressif de transformer les fibroblastes pointe queue murine PEI via transcription axés sur le facteur lignée directe reprogrammation (DLR). Dans cet exemple, nous effectuons la reprogrammation dans les fibroblastes de souris de traçage lignée érythroïde qui expriment la protéine fluorescente jaune (YFP) sous le contrôle du promoteur du gène (EpoR) érythropoïétine récepteur, permettant la visualisation des cellules érythroïdes induction de sort à la reprogrammation. Suite à ce protocole, les fibroblastes peuvent être reprogrammées en PEI dans les cinq à huit jours.
Tandis que les améliorations peuvent encore être apportées au processus, nous montrons qu’induite par le GTLM reprogrammation est un processus rapid et direct, ce qui donne des cellules avec des propriétés de bona fide cellules progénitrices et précurseurs érythroïdes.
Introduction
Globules rouges (hématies) sont essentiels chez tous les vertébrés et représentent 84 % de toutes les cellules du corps humain1. D’embryonnaire à l’âge adulte, notre santé est fortement tributaire de réglage exact de l’homéostasie de la RBC. La production continue des hématies matures au cours du développement à l’âge adulte est connue comme l’érythropoïèse. Un défi majeur dans la recherche de l’érythropoïèse est de définir les régulateurs maîtres qu’orchestrent le développement de RBC et le commutateur entre érythropoïèse primitive et définitive. Reprogrammation de la lignée directe des progéniteurs érythroïdes présente une opportunité de mieu....
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Protocole
1. la création et l’entretien de queue de souris primaire astuce Cultures de fibroblastes
- Préparer des plats enduit de gélatine (recommande un plat de 10 cm pour une queue) en recouvrant la surface avec de la gélatine de 0,1 % et en incubant les plats pendant environ 20 min à 37 ° C. Aspirer la solution de gélatine du plat et laisser sécher pendant au moins 2 h.
- Euthanasier les souris par dislocation cervicale. Enlever la queue avec des ciseaux, coupant à la base de la queue. Mettre la queue dans une solution saline de Dulbecco tamponnée au phosphate (SPD) avec 2 % sérum fœtal (SVF) jusqu'à utilisation.
Remarque : Pour des résultats optimaux, qu....
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Résultats
Nous présentons ici un protocole reproductible pour la production de PFE de fibroblastes adultes à l’aide de DLR pilotée par facteur de transcription. Nous évaluons la reprogrammation de cellules à l’aide de la cytométrie en flux, formatrices dosages et gène analyse de l’expression. Afin d’aider à la visualisation de la conversion au destin des cellules érythroïdes, nous avons effectué la reprogrammation sur les fibroblastes des souris de lignée-traçage érythroïdes (Epor- Cre
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Discussion
La surexpression d’un cocktail de quatre facteurs, GATA1, TAL1, LMO2 et c-MYC (GTLM), est suffisante pour reprogrammer les fibroblastes murins et humains directement aux PFÉ10. Les cellules érythroïdes reprogrammé ressemblait beaucoup aux progéniteurs érythroïdes bona fide en ce qui concerne la morphologie, phénotype, expression génique et capacité de formatrices. Cette constatation co.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts au rapport.
Remerciements
Nous remercions Evelyn Wang et Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge (Massachusetts) pour le clonage et Harvey Lodish (Whitehead Institute) fournissant plusieurs des plasmides utilisés pour générer la bibliothèque rétrovirale. Nous remercions Kavitha Siva et Sofie Singbrant (département de médecine moléculaire et Gene Therapy, Université de Lund), Göran Karlsson et Shamit Soneji (département d’hématologie moléculaire, Université de Lund) pour leur rôle dans la description de la production de l’iEP. Nous tenons également à remercier Julian Pulecio (Centre de la médecine régénératrice, Barcelone Biomedical Research Park), Violeta rayonne-Estrada (The Rockefeller ....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM sans pyruvate de sodium | GE Life Sciences | SH30022.01 | Milieux de culture pour cellules PhGP |
| DMEM avec pyruvate de sodium | GE Life Sciences | SH30243.01 | Milieux de culture pour fibroblastes de l’extrémité de la queue |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Milieux de reprogrammation ; |
| Sérum fœtal bovin HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Facteur de croissance |
| Pénicilline/Streptomycine HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Acides aminés non essentiels antiboiotiques |
| (100x) | Le milieu Thermo Fisher | 11140050 | SNL est complété par ce |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Agent de dissociation cellulaire |
| Facteur de cellules souches murines (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Ajouté au milieu de reprogrammation |
| Souris recombinante Il-3 | Peprotech | 213-13 | Ajouté au milieu de reprogrammation |
| érythropoïétine recombinante humaine (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Ajouté au milieu de reprogrammation |
| Dexaméthasone | Sigma | 50-02-2 ; ; | Ajouté aux supports de reprogrammation |
| Gélatine de peau de porc | Sigma | 9000-70-8 | Dissovaqué en dH2O et utilisé pour le revêtement des plaques. Assurez-vous de la stérilité avant utilisation. |
| Chlorhydrate de blasticidine S | Sigma 3 | /9/3513 | Antibiotique de sélection. Affecte à la fois les cellules pro- et eucaryotes |
| Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Utilisé pour les étapes de lavage |
| Polybrène | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection ; Réactif |
| FuGENE HD Réactif de transfection | Promega | E2311 | Réactif de transfection pour lignée cellulaire PhGP |
| Millex-GP Unité de filtre à seringue 0,22 & micro ; m | Merck | SLGP033RS | Utilisé pour filtrer le surnageant de virus |
| BD Seringue hypodermique émeraude Becton | Dickinson | SKU : 307736 | Utilisé pour filtrer le surnageant de virus |
| 100 mm Plat de culture | Corning | 430167 | Culture cellulaire |
| Plaque à 6 puits | Falcon | 10799541 | Culture cellulaire |
| Pince de bijoutier #5 | Sklar | 66-7642 | Utilisé pour manipulation de petits fragments de queue |
| Sklarlite Iris Ciseaux | Sklar | 23-1149 | Utilisé pour couper la queue en petits morceaux |
| Kit de déplétion cellulaire de lignée, souris | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Pour l’appauvrissement des cellules hématopoïétiques dans les cultures de fibroblastes |
| CD117 Microbilles, souris | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | Pour l’appauvrissement des cellules hématopoïétiques dans les cultures de fibroblastes |
| Cellules PheonixGP | ATCC | CRL-3215 | Lignée cellulaire d’emballage rétroviral |
| Vecteur EcoPAC (pCL-Eco) ; | Novus Biologicals | NBP2-29540 | Vecteur auxiliaire rétroviral contenant les gènes gag et pol |
| pMX-Gata1 | Cloné en laboratoire | ||
| pMX-Tal1 | Cloné en laboratoire | ||
| pMX-Lmo2 | Cloné en laboratoire | ||
| pMX-cMyc | Cloné en laboratoire | ||
| Logiciel CellSens Standard 1.6 ; | Logiciel d’analyse Cytospin |
Références
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M.
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Réimpressions et autorisations
