Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het identificeren van homologe recombinatie gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern blotting en/of PCR. Deze methode wordt geïllustreerd door de generatie van nonmuscle myosin II genetische vervanging Muismodellen met behulp van traditionele embryonale stamcel gebaseerde homologe recombinatie-gemedieerde targeting technologie.
Abstract
Ten opzichte van de kwesties van off-target effecten en de moeilijkheid van het invoegen van een lang fragment van DNA in de toepassing van ontwerper nucleasen voor genoom editing, embryonale stamcellen (ES) cel-gebaseerde gentargeting technologie beschikt niet over deze tekortkomingen en wordt op grote schaal gebruikt voor het wijzigen van dier/muis genoom variërend van grote verwijderingen/ingevoegde tot één nucleotide vervangingen. Met name, identificatie van de relatief weinig homologe recombinatie (HR) gebeurtenissen nodig zijn om de gewenste ES klonen is een belangrijke stap, die vraagt om accurate en betrouwbare methoden. Southern blotting en/of conventionele PCR worden vaak gebruikt voor dit doel. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures van die twee methoden gebruiken voor het identificeren van HR gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis ES cellen waarin het endogene Myh9-gen is bedoeld om te worden verstoord en vervangen door cDNAs codering van andere nonmuscle myosin zware ketting IIs (NMHC IIs). De hele procedure van Southern blotting omvat de bouw van targeting vector(s), electroporation, selectie van de drug, de uitbreiding en de opslag van ES cellen/klonen, de voorbereiding, de spijsvertering en van genomic DNA (gDNA), de kruising bevlekken en wassen van probe(s), en een laatste stap van autoradiografie op de X-ray films. PCR kan worden uitgevoerd rechtstreeks met bereid en verdunde gDNA. Ideaal om resultaten te verkrijgen, moeten de sondes en restrictie-enzym (her) snijden sites voor het Zuidelijke bevlekken en de inleidingen voor PCR zorgvuldig worden gepland. Hoewel de uitvoering van de Southern blotting is tijdrovend en arbeidsintensief en PCR-resultaten hebben valse positieven, de juiste identificatie door Southern blotting en de snelle screening door PCR de uitsluitende of gezamenlijke toepassing van deze methoden toestaan in deze paper wijd gebruikt en geraadpleegd te worden door de meeste laboratoria in de identificatie van genotypen van ES-cellen en genetisch gemodificeerde dieren.
Introduction
De technologie van gen richten door HR in lymfkliertest ES-cellen zorgt voor een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de cellulaire gevolgen van specifieke genetische mutaties1,2. Het belang en de betekenis van deze technologie worden weerspiegeld in de erkenning ervan door 2007 de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde3,4; Ondertussen, het vertegenwoordigt de komst van het moderne tijdperk van gene engineering5. Gen richten via HR kan worden gebruikt om ingenieur vrijwel elke wijziging variërend van puntmutaties tot grote chromosomale herschikkingen in het genoom van muis ES cellen6,7. Het is algemeen bekend dat, vóór de opkomst van de zogenaamde genoom bewerkingsgereedschappen, de generatie van een gen knockout muis de toepassing van gentargeting technologie in ES cellen8,9,,10 vereist. Tijdens de afgelopen twee decennia, werden meer dan 5.000 gen-gerichte muizen geproduceerd door deze benadering voor het modelleren van ziekten bij de mens of studeren gene functies11. De inspanning van een genoom-brede knock-out is opgezet voor het distribueren van gentargeting vectoren, gerichte ES cel klonen en levende muizen naar de wetenschappelijke gemeenschap2,12,13,14 , 15. ongetwijfeld ES cel-gebaseerde HR-gemedieerde gentargeting technologie zich sterk ontwikkeld ons begrip van de functies van genen in fysiologische of pathologische verband gespeeld.
Omdat HR is een relatief zeldzame gebeurtenis in zoogdieren16,17, de belangrijke cellen en volgende stap na is gentargeting in lymfkliertest ES-cellen voor het analyseren van de talrijke kolonies van de ES voor het identificeren van een paar klonen met mutaties die voortvloeien uit HR met de targeting vector18. De gouden methoden voor het identificeren van HR gebeurtenissen omvatten Southern blotting en PCR19,20. De voordelen van de benaderingen omvatten dat Southern blotting correct gerichte ES klonen identificeren kunt en toelaat van onderzoekers voor het analyseren van de structuur van het gen-gerichte evenement, zoals een verificatie van de invoeging van een enkel exemplaar van de constructie, terwijl een PCR gebaseerde strategie vergunningen meer snelle screening voor HR gebeurtenissen21,22. Al deze methoden nadelen, zoals hebben dat ze tijdrovend en kunnen hebben valse positieven, de combinatorische gebruik van hen is breed geaccepteerd en toegepast door de meeste laboratoria in het identificeren van HR gebeurtenissen, vooral in ES-cellen, voor genereren van genetisch gemodificeerde dieren.
Drie isoforms van nonmuscle myosin II (NM II) in zoogdieren, elk bestaande uit twee identieke NMHC IIs die zijn gecodeerd door drie verschillende genen (met de naam Myh9, Myh10, en Myh14) en twee paren van lichte kettingen, worden aangeduid als NM II-A en II-B II-C23. Eerdere studies hebben aangegeven dat ten minste de isoforms van NM II-A en II-B zijn essentieel voor de ontwikkeling van de muis, omdat de in-vivo -ablatie van deze isoforms in embryonale letaliteit24,25,26 resulteert. Om dit probleem te omzeilen en het verkrijgen van nieuwe inzichten in de isovorm-specifieke functies van NM II-A en II-B in de latere stadia van de ontwikkeling van de muis, een genetische vervanging strategie met behulp van ES cel-gebaseerde HR-gemedieerde gentargeting technologie werd aangenomen het genereren van een serie van muis modellen27. In de loop van het identificeren van de gewenste ES klonen, zowel Southern blotting en PCR methodes werden gebruikt, en dit bleek te zijn efficiënt en betrouwbaar27,28.
Deze paper wil een gedetailleerde beschrijving van het Zuidelijke bevlekken en PCR, met inbegrip van het ontwerp van de doelgerichtheid van vector(s), probe(s), en inleidingen en de uitvoering van experimenten, evenals de analyse van de resultaten wordt geïllustreerd door het identificeren van HR gebeurtenis voorval in ES-cellen voor het creëren van genetische vervanging NM II muis modellen en representatieve gegevens. De protocollen van deze twee methoden die hier gepresenteerd kunnen ook worden vastgesteld voor de identificatie van de genotypen van genetisch gemodificeerde cellen of dieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Op dit moment vervangen ontwerper nucleasen voor het bewerken van het genoom nog steeds niet ES cel-gebaseerde gentargeting technologie als gevolg van de problemen van off-target effecten en problemen bij het invoegen van een lange DNA fragment30,31. Als de gouden methoden voor het identificeren van HR gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis ES-cellen, biedt dit verslag een gedetailleerd protocol van Southern blotting en PCR voor het veld. We de betrouwb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk kreeg steun van het algemene programma van nationale Natural Science Foundation van China (subsidies nr. 31571432), de menselijke provinciale Natural Science Foundation van China (Grant No. 2015JC3097) en het onderzoek Stichting voor onderwijs Bureau van Hunan Provincie, China (Grant No. 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
