זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לזיהוי רקומבינציה הומולוגית אירועים שהתרחשו במהלך בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג בדרום ו/או ה-PCR. שיטה זו היא כשניסחתי את הדור של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II גנטי החלפת העכבר מודלים בטכנולוגיה המסורתית עובריים מבוססי תאי גזע הומולוגי בתיווך רקומבינציה מיקוד.
Abstract
יחסית הנושאים של תופעות מחוץ-יעד, הקושי של הוספת קטע DNA ארוך היישום של nucleases מעצבים עבור גזע עובריים, עריכה הגנום (ES) מבוססת תא פילוח ג’ין אין חסרונות אלה וטכנולוגיה הוא נרחב משמש לשינוי הגנום חיה/עכבר ועד מחיקות גדולות/הוספות החלפות נוקלאוטיד יחיד. ראוי לציין, זיהוי אירועי רקומבינציה הומולוגית (HR) מעטים יחסית צורך להשיג הרצוי ES שיבוטים נמצא צעד מפתח, אשר דורש שיטות מדויקות ואמינות. סופג בדרום ו/או קונבנציונלי PCR מנוצלים לעיתים קרובות למטרה זו. כאן, אנו מתארים את תהליכי מפורט באמצעות אלה שתי שיטות לזיהוי HR אירועים שהתרחשו במהלך העכבר ES תאים שבהם הגן Myh9 אנדוגני נועד להיות משובשות והוחלף cDNAs קידוד אחרים nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה IIs (NMHC IIs). כל הליך סופג הדרומי כולל הקמת מיקוד vector(s), אלקטרופורציה, הבחירה בסמים, הרחבה, אחסון של ES תאים/שיבוטים, הכנה, עיכול, סופג של דנ א גנומי (gDNA), הכלאה של כביסה של probe(s), צעד סופי של autoradiography על הסרטים רנטגן. PCR יכול להתבצע ישירות עם gDNA מוכן, מדולל. כדי להשיג תוצאות אידיאלי, המחקרים וכל אנזים הגבלה (מחדש) חיתוך אתרים עבור סופג בדרום, את צבעי יסוד PCR צריך להיות תכננה בקפדנות. למרות ביצוע סופג הדרומי הוא מהגידולים ועתירת ויש PCR תוצאות חיוביות שגויות, הזיהוי הנכון על ידי סופג הדרומי ואת ההקרנה מהירה על ידי ה-PCR לאפשר היישום הבלעדית או בשילוב של שיטות אלה תיאר נייר זה להיות בשימוש נרחב ולא התייעץ על ידי רוב מעבדות הזיהוי של אחרים של תאים ES, גנטית שונה בבעלי חיים.
Introduction
הטכנולוגיה של ג’ין פילוח על-ידי HR מאתר ES תאים מספקת כלי רב עוצמה לנתח את ההשלכות הסלולר של מוטציות גנטיות מסוימות1,2. החשיבות והמשמעות של טכנולוגיה זו משתקפים ההכרה על ידי 2007 פרס נובל לפיזיולוגיה או לרפואה3,4; בינתיים, הוא מייצג את כניסתו של העידן המודרני של גנים הנדסה5. גן מיקוד דרך בית יכול להיות מנוצל כדי להנדס כמעט כל שינוי החל מוטציות נקודה גדולה rearrangements כרומוזומליות בגנום של העכבר ES תאים6,7. זה ידוע כי, לפני הופעתם של כלי עריכה הגנום כביכול, הדור של עכבר נוקאאוט גנטי נדרש היישום של טכנולוגיה פילוח ג’ין ES תאים8,9,10. במהלך שני העשורים האחרונים, יותר מ-5,000 גן במיקוד עכברים יוצרו על ידי גישה זו עבור מידול מחלות אנושיות או לומד ג’ין פונקציות11. מאמץ ההסתרה הגנום כולו הוקם להפצת וקטורים פילוח ג’ין, יישוב ES תא שיבוטים ועכברים בשידור חי הקהילה המדעית2,12,13,14 , 15. אין ספק, ES מבוססת תא בתיווך HR פילוח ג’ין הטכנולוגיה מאוד התקדמה הבנתנו הפונקציות של גנים שיחק בהקשר פיזיולוגיים או פתולוגי.
מאחר HR הינה אירוע יחסית נדירים מידע יונקים תאים16,17, הדבר החשוב, הצעד הבא בעקבות ג’ין פילוח מאתר ES התאים היא לנתח את מושבות רבות ES לזיהוי כמה שיבוטים עם מוטציות הנובעות HR עם הפגיעה המכוונת וקטור18. השיטות זהב לזיהוי אירועים ביממה כוללים סופג בדרום ו- PCR19,20. היתרונות של הגישות כוללות כי סופג הדרומי ניתן לזהות כראוי יישוב ES שיבוטים, מאפשר לחוקרים לנתח את המבנה של האירוע גן במיקוד, כגון אימות של החדרת עותק בודד הבונה, בזמן אסטרטגיה מבוסס ה-PCR מאפשרת הקרנה מהירה יותר של HR אירועים21,22. למרות ששיטות אלה יש חסרונות כגון כי הם זמן רב, תוכלו לעשות תוצאות חיוביות שגויות, השימוש קומבינטוריים אותם הוא נרחב התקבלה, שהוחלו על-ידי רוב מעבדות לזיהוי אירועים HR, ובמיוחד ב תאים ES, עבור יצירת גנטית שונה בעלי חיים.
שלושה איזופורמים של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II (NM II) ביונקים, שכל אחד מהם מורכב של שני IIs NMHC זהים אשר מקודדים על ידי שלושה גנים שונים (בשם Myh9, Myh10 ו- Myh14), שני זוגות של שרשראות אור, מכונים NM II-A II-B, II-C23. מחקרים קודמים הראו כי לפחות איזופורמים של NM II-A ו- II-B חיוניים לפיתוח העכבר כי אין ויוו אבלציה של אלה איזופורמים התוצאות הקטלניות עובריים24,25,26. כדי לעקוף בעיה זו ולקבל הרומן תובנות פונקציות ספציפיות isoform של NM II-A ו- II-B בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח העכבר, תחליף גנטי אסטרטגיה ES מבוססת תא בתיווך HR פילוח ג’ין בטכנולוגיית אומצה על ליצור סדרה של מודלים העכבר27. במהלך זיהוי שיבוטים ES הרצוי, סופג בדרום והן שיטות PCR נוצלו, אלה הוכח להיות יעיל ואמין27,28.
הנייר הזה מתכוון לספק תיאור מפורט של סופג דרום ו PCR, כולל העיצוב של מיקוד vector(s), probe(s), תחל ואת ביצוע ניסויים, כמו גם הניתוח של תוצאות כשניסחתי זיהוי האירוע HR התרחשות תאים ES ליצירת החלפת גנטי NM II העכבר נציג נתונים ומודלים. הפרוטוקולים של שתי השיטות המובאות כאן ניתן לאמץ גם לזיהוי של אחרים של תאים מהונדסים או בעלי חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כיום, nucleases מעצבים לעריכה הגנום עדיין לא ניתן להחליף ES תא פילוח ג’ין טכנולוגיה מבוססת עקב בעיות שלה של אפקטים את המטרה, קושי הוספה של זמן DNA פרגמנט30,31. כמו השיטות הזהב לזיהוי HR האירועים שקרו העכבר ES תאים, דוח זה מספק פרוטוקול מפורט של סופג הדרומי, PCR עבור השדה. נ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו קיבלה תמיכה מהתוכנית הכללית של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מענקים מס 31571432), את האנושי מחוזי מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 2015JC3097), את המחקר קרן של החינוך הלשכה של הונאן פרובינציה, סין (מענק מס 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
