Separation av spenat tylakoida proteinkomplex av infödda grön gelelektrofores och bandet karakterisering med Time-Correlated Single Photon Counting

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att separera solubilized tylakoida komplex med infödda grön gelelektrofores. Grön gel band kännetecknas därefter av tid korrelerade Single Photon Counting (TCSPC) och grundläggande steg för dataanalys finns.

Abstract

Ljus reaktionerna fotosyntes utförs av en serie pigmenterade proteinkomplex i tylakoida membran. Det stökiometri och organisationen av dessa komplex är högdynamiska på både långa och korta tidsskalor på grund av processer som anpassa fotosyntesen till förändrade miljöförhållanden (dvs. icke-fotokemiska snabbkylning, tillståndsövergångar, och den långsiktiga svar). Historiskt har dessa processer har beskrivits spectroscopically när det gäller förändringar i klorofyll fluorescens och spektroskopi förblir en viktig metod för att övervaka fotosyntetiska parametrar. Det finns ett begränsat antal sätt där den underliggande protein complex dynamiken kan visualiseras. Här beskriver vi en snabb och enkel metod för högupplösta separation och visualisering av tylakoida komplex, inbyggda grön gelelektrofores. Denna metod är tillsammans med tid-korrelerade enda fotonen räkna för detaljerad karakterisering av klorofyll fluorescens egenskaper band separeras på grön gel.

Introduction

Fotosyntetiska organismer måste hela tiden anpassa sin fysiologi till förändrade miljöförhållanden att maximera sin produktivitet och framgångsrikt konkurrera med grannar¹. Detta gäller särskilt maskinens ansvarar för ljus reaktionerna fotosyntes, som omgivande ljus villkor kan fluktuera med tre tiopotenser mellan skuggor och fullt solljus. Miljöfaktorer såsom torka, kyla eller värmestress kan dessutom minska tillgängligheten av koldioxid för kol fixering, som är naturliga elektron diskbänken för produkter av ljus reaktionerna. Växter måste, därför skörda och utnyttja solstrålning så effektivt som möjligt samtidigt behålla möjligheten att skingra överskott ljus energi som behövs. Medan photooxidative skador fortfarande uppstår rutinmässigt under alla ljusförhållanden^2,3, misslyckande att hantera absorberas exciteringsenergi framgångsrikt kan leda till katastrofala cellskador och döden. Flera adaptiva mekanismer finns som tillåter fotosyntetiska apparaten stämmas både förändringar i rådande miljöförhållanden och övergående fluktuationer (dvs. över både långa och korta tidsskalor)⁴. Dessa inkluderar långsiktiga svar (LTR) och icke-fotokemiska kylning (NPQ). NPQ är i sig anses omfatta minst tre andra komponent fenomen, inklusive tillståndsövergångar (qT), släcka snabbt inducerbara energi (qE) och photoinhibition (qI)⁵.

Dessa processer var ursprungligen observerade och definieras i hög grad genom spektroskopiska fenomen [t.ex. NPQ refererar till en droppe i observerade klorofyll fluorescens (kylning av klorofyll fluorescens) som inte beror på en ökning av andelen Fotokemi]⁶. Termen ”state transitions” på samma sätt avser observerade ändringen i det relativa beloppet av fluorescens från PSI och PSII⁷. Medan de spektroskopiska tekniker som har möjliggjort en uppräkning av dessa fenomen [i synnerhet pulsamplitud modulerade (PAM) fluorescens-spektroskopi] och fortsätta att vara ett viktigt medel för observation och dissekera fotosyntetiska processer i vivo, en hel del av biokemi som krävs för att klarlägga mekanismerna bakom dessa spektroskopiska observationer. Statliga övergångar, innebär exempelvis en fosforylering/Defosforylering cykel av LHCII proteiner av STN7 kinase och TAP38/PPH1 fosfatas, respektive^8,9,10. Denna cykel justerar fysiska distributionen av LHCII antennen mellan de två fotosystem genom att flytta en del av LHCII trimerer från PSII PSI, därmed förändra absorptionen tvärsnitt av fotosystem^11,12. Komponenten qE i NPQ omvandlar snabbt överflödig excitation energi till värme genom violaxanthin/zeaxantin epoxidering/de-epoxidering cykeln och proteinet PsbS agerande. PsbS exakta roll i denna process är fortfarande inte helt klarlagt¹³. Komponenten qI i NPQ, photoinhibition, är allmänt tillskrivs skada till D1 proteinet av PSII. Restaurering av full fotosyntetiska kompetens kräver en genomarbetad reparationsprocessen fixar skadade PSII photocenters. PSII reparera cykeln innebär migration av PSII komplex ur den granal stackar, demonteringen av komplexen, byte av skadade D1 proteiner, ihopsättning av PSII komplexen och förflyttning av PSII komplex tillbaka till den granal stackar¹⁴. Den exakta innebörden av photoinhibition och PSII åldrad hud är fortfarande föremål för intensiv granskning¹⁵.

Svårigheten att studera fenomen som stat övergångar eller PSII reparation uppstår delvis från det faktum att det finns inte ett enkelt sätt att visualisera komplexa biokemiska system mekanik. Den klassiska biochemical tillvägagångssätt att förstå en process är att först skilja dess komponenter så att de kan karakteriseras i isolering. Infödda gelelektrofores uppstod från framgångsrika insatser på 1980-talet att separera och karakterisera de fotosystem komplex från tylakoida membran med fler förberedande metoder (nämligen sackaros gradient centrifugering och kromatografi)¹⁶. De tvättmedel system utvecklat för att försiktigt solubilize de infödda komplex från tylakoida membranen anpassades snart till elektroforetisk separationsmetoder, framför allt genom Allen och Staehelin¹⁷ och och Peter och Thornber¹⁸, ger upphov att infödda grön gelelektrofores. Samtidigt som företräder enda ur en mängd olika tekniker i den experimentella arsenalen, infödda sida har ett antal attraktiva egenskaper som har gjort det en allmänt sysselsatta metod i fotosyntesen forskning. Infödda sida är relativt snabb och enkel, kräver lite specialutrustning, samtidigt som den ger hög upplösning separation av ett stort antal tylakoida komplex samtidigt. Detta gör infödda sida ett praktiskt verktyg för att studera tylakoida dynamics och, när de kombineras med STANDARDSIDA i den andra dimensionen samt en mängd tvättmedel och buffert-system, ett mångsidigt system för att hitta och karakterisera nya tylakoida komplex.

Som sagt, har infödda grön geler haft ett rykte om att vara en opålitlig teknik, särskilt i oerfarna händer, eftersom det är lätt att producera dåliga resultat bestående av fuzzy, smetig geler med några band. Problemet var löst, delvis, med införandet av blå-native sida¹⁹. Coommassie färgämnet i BN buffert systemet gör protein separation mer robust. Därför, BN-sida är ofta en enklare och mer tillförlitlig teknik för en relativ nybörjare att ställa in och kan ge hög upplösning separationer av tylakoida komplex. Av dessa skäl blivit BN-sida vald analysmetod för de flesta arbete i det här fältet. Medan BN-sidan är i allmänhet långsammare att köra än gröna gelelektrofores, dess huvudsakliga nackdelen är att den coommassie färgämnet färgning stör identifiering av svag klorofyll-innehållande band, samtidigt också göra nedströms spektroskopiska karakterisering problematiska.

Den biokemiska informationen tillhandahålls av infödda geler och 2D SDS-PAGE kan stärkas kraftigt när de kombineras med data från spektroskopiska tekniker. Oavsett systemets sysselsatt, centrala problem med att använda inhemska geler för att identifiera komplex är att identifieringen alltid kan ifrågasättas (dvs. proteinerna som finns i ett band kunde alltid representerar comigrating komplex eller komponenter, snarare än en enstaka fysiologiskt autentiska komplex). Spektroskopiska karakterisering ger biofysiska information om pigmenten i grön gel band och kan användas för att bestämma vilka typer av komplex de sannolikt kommer att innehålla. Klorofyll fluorescensen är särskilt användbart i detta sammanhang på grund av de ofta dramatiskt olika spektra och fluorescens livstider som är karakteristiska för olika fotosyntetiserande pigment-proteinkomplex. Medan enkla steady state 77K fluorescens spectra har historiskt sett varit användbar för att bekräfta identiteter för infödda gel komplex, kan moderna tid-korrelerade single photon counting (TCSPC) ge mycket mer information. TCSPC tillåter inte bara karakterisering av komplex baserat på fluorescens livstider, men också möjliggör en detaljerad beskrivning av energiöverföring mellan spektrala komponenter i ett komplex. Denna typ av karakterisering allt viktigare som användning av olika inhemska gel system sprider och ny förmodad komplex upptäcks, möjliggör identifiering av proteinkomplex autentiseras bättre och tillhandahålla nya biofysiska information om hur dessa komplex fungerar.

I detta dokument ger vi en metod som gör det möjligt för dem som har liten eller ingen erfarenhet med infödda gelelektrofores att uppnå hög kvalitet upplösning av infödda tylakoida komplex i syfte att undersöka mekaniken i ljus reaktioner fotosyntesen. Denna grundläggande teknik kan sedan utökas de experimenter’s eget gottfinnande att förbättra resultat eller utvidga tillämpligheten till andra arter. Sedan beskriver vi processen för att utsätta infödda grön gel band för TCSPC, samt några steg för grundläggande analys och presentation av data som tillhandahålls av tekniken. Kopplingen av infödda gelelektrofores med TCSPC analys sträcker sig nyttan av dessa gel system genom att tillhandahålla autentisering och biofysiska karakterisering av proteinkomplex inom banden. Grön gel systemet beskrivs här baseras på som utvecklats av Allen och Staehelin¹⁷ med vissa modifieringar och är samma som används i Schwarz et al. ²⁰. detta system är en av många men har specifika funktioner som är användbara för denna metod. Det är snabb nog så att tylakoida isolering, gelelektrofores och TCSPC analys bekvämt kan utföras på en dag, undanröja potentiella problem för förvaringen och nedbrytning. Vi tycker också att denna metod är robust i händerna på oerfarna användare, samtidigt som det ger resultat som sträcker sig från bra till överlägsen, beroende på graden av optimering.

Det är viktigt att komma ihåg att de komplex som visualiseras på en native gel beror på både tvättmedel och buffert-system som används, samt på biologin av organismen under utredning. Olika rengöringsmedel och buffert system separera företrädesvis olika typer av komplex, och en given fotosyntetiska organismer har olika komplex från andra organismer, inte alla som kommer att närvara under en viss omständighet. Systemet beskrivs här är särskilt lämpad för studiet av PSI megacomplexes, som beskrivs i Schwarz et al. ²⁰, men det faller på den mer destabiliserande änden av spektrumet för de som studerar PSII megacomplexes. För en omfattande studie av de olika tvättmedel och buffert system som används i inhemska gelelektrofores av tylakoida proteiner, är det rekommenderat att granska Järvi et al. ²¹ och Rantala o.a. ²².

Protocol

1. stamlösningar förberedelse för hälla infödda grön geler Förbereda en 4 x buffertlösning med koncentrerad för att lösa geler som består av 40% glycerol, 200 mM glycin och 100 mM Tris buffrad till pH 8,3. Förbereda en 4 x koncentrerad buffertlösning för stapling geler som består av 40% glycerol, 200 mM glycin och 100 mM Tris buffrad till pH 6,3. Lagra dessa buffertar vid 4 ° C att förhindra tillväxt av mögel.Obs: Buffertar är stabila i månader vid 4 ° C, så beredn…

Representative Results

Representativa resultat för gröna gelelektrofores presenteras i figur 1. Lane 1 innehåller ett exempel på perfekt resultat för grön gelelektrofores av spenat thylakoids, där ett maximalt antal tydliga, skarpa gröna band är synliga. Dessa resultat är något atypiska, delvis eftersom inte alla de band som uppträder hos lane 1 finns normalt i ett givet prov. Ytterligare prov rensning, i form av kloroplast isolering innan tylakoida lösbarhet och gradi…

Discussion

En framgångsrik tylakoida lösbarhet och infödda gel kör kommer att resultera i resolutionen av flera distinkta synliga gröna band på gel utan betydande snedvridning eller smetar av banden. Överbelastning av gel, en hög tvättmedel koncentration, en Felaktiga prov pH, oupplösta material, Kör gelen alltför snabbt eller vid för hög temperatur, och ett felaktigt hällde gel är alla faktorer som kan bidra till dåligt löst tylakoida komplex. Samtidigt optimera villkoren i gelen själv (t.ex., akrylamid…

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333