Storproduktion af rekombinant RNA'er på en cirkulær stillads ved hjælp af en Viroid-afledte System i Escherichia coli

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til at producere store mængder af rekombinant RNA i Escherichia coli co udtrykke en kimære RNA, der indeholder RNA interesse i en viroid stillads og en plante tRNA ligase. Det vigtigste produkt er en cirkulær molekyle, der letter rensning til ensartethed.

Abstract

Med stigende interesse i RNA biologi og brugen af RNA molekyler i avancerede bioteknologiske applikationer, er metoder til at producere store mængder af rekombinant RNA’er begrænset. Her, vi beskriver en protokol til at producere store mængder af rekombinant RNA i Escherichia coli baseret på fælles udtryk for en kimære molekyle, der indeholder RNA interesse i en viroid stillads og en plante tRNA ligase. Viroider er relativt små, ikke-kodende, stærkt base-parret cirkulære RNA’er, der er smittefarlige til højere planter. Værten plante tRNA ligase er et enzym, der er ansat af viroider, der tilhører familien Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd), for at mægle RNA circularization under viroid replikering. Selv om ELVd ikke replikerer i E. coli, en ELVd forløber effektivt er transskriberet af E. coli RNA polymerase og behandles af integrerede hammerhead ribozymer i bakterieceller, og de deraf følgende monomerer er circularized af den Co udtrykt tRNA ligase at nå frem til en bemærkelsesværdig koncentration. Indføjelsen af et RNA interesse i ELVd stillads muliggør fremstilling af snesevis af rekombinant RNA pr. liter bakteriekulturen regelmæssig laboratoriegodkendte mg. En vigtigste brøkdel af RNA produkt er cirkulær, en funktion, der letter rensning af af rekombinante RNA til virtuelle homogenitet. I denne protokol, er en supplerende DNA (cDNA) svarende til RNA af interesse indsat i en bestemt stilling af ELVd cDNA i et udtryk plasmidet, som langs plasmid Co udtrykke aubergine tRNA ligase, bruges til at omdanne E. coli. Co udtryk for begge molekyler under kontrol af stærke konstitutiv projektledere fører til produktion af store mængder af af rekombinante RNA. Den rekombinante RNA kan udvindes fra de bakterieceller og adskilt fra hovedparten af bakteriel RNA’er udnytter sin cirkularitet.

Introduction

I modsætning til DNA og proteiner er protokoller for nem, effektiv og omkostningseffektiv produktion af store mængder af RNA ikke rigelige. Men forskning og industri efterspørgsel stigende mængder af disse biomolekyler at undersøge deres unikke biologiske egenskaber¹, eller at være ansat i avancerede bioteknologiske applikationer, herunder deres brug som meget specifikke aptamers ², terapeutiske agenter³eller selektiv pesticider⁴. In vitro transskription og kemisk syntese er almindeligt anvendt i forskning til at producere RNA. Men disse metoder indebærer vigtige begrænsninger når store mængder af produkterne, der er påkrævet. Den logiske alternativ er at bruge den endogene transskription maskiner af levende celler, efterfulgt af en rensningsproces at adskille RNA’er af interesse fra den cellulære ledsagere. Efter denne strategi metoder er blevet udviklet til at producere rekombinant RNA’er i bakterieceller, såsom lab-venlige Escherichia coli⁵ eller den marine lilla fototopiske alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum ⁶. de fleste metoder til at producere rekombinant RNA i bakterier stole på udtryk for en indfødt yderst stabil RNA stillads, såsom en tRNA eller en rRNA, hvor RNA af interesse er indsat⁷. Dette pålægger nødvendigheden af at frigive RNA af interesse fra de kimære molekyle, hvis tilstedeværelsen af ekstra RNA er et problem for downstream programmer⁸. Et andet koncept i rekombinant RNA bioteknologi er produktionen af rekombinante ribonucleoprotein komplekser, som kan være den ønskede vare i sig selv eller bruges som en beskyttende strategi til at øge stabiliteten i RNA interesse^{9, 10}. På samme måde, er produktionen af cirkulære RNA’er også blevet foreslået som en strategi til at generere mere stabile produkter¹¹.

Vi har for nylig udviklet en ny metode til at producere store mængder af rekombinant RNA i E. coli , der deltager i tre af de ovennævnte begreber: indsættelse af RNA af interesse i en yderst stabil cirkulært RNA stillads og co udtryk for den rekombinant RNA med en interagerende protein sandsynligvis producere en stabil ribonucleoprotein kompleks, der ophobes i bemærkelsesværdigt beløb i bakteriel celler¹². I modsætning til tidligere udvikling brugte vi en RNA stillads helt fremmed for E. coli, nemlig en viroid. Viroider er en meget bestemt type af smitsomme agenser af højere planter, der er udelukkende udgøres af en relativt lille (246-401 nt) meget base-parret cirkulært RNA¹³. Interessant, viroider ikke-kodende RNA’er, og ingen hjælp fra deres egne proteiner, de er i stand til at fuldføre komplekse smitsomme cykler i inficerede værter¹⁴. Disse cyklusser omfatter RNA til RNA replikering i kerner eller grønkorn, afhængigt af familien viroid —Pospiviroidae eller Avsunviroidae, henholdsvis — bevægelse gennem de inficerede anlæg og unddragelse af vært defensive svar. Viroider skal være rangeret blandt de mest stabile RNA’er i naturen, som følge af at være en nøgen cirkulært RNA og skulle overleve i den barske miljø af inficeret planteceller. Denne egenskab kan gøre viroider især velegnet som stilladser til at stabilisere rekombinant RNA i bioteknologiske metoder. Desuden er den nye metode baseret på fælles udtryk for viroid stillads med en interagerende vegetabilske proteiner. Viroider replikere gennem en rullende cirkel mekanisme i hvilken vært enzymer er rekrutteret til at katalysere de forskellige trin i processen. Især nogle viroider, mere konkret dem, der tilhører familien Avsunviroidae¹⁵, indeholder ribozymer, der er også involveret i replikation. Dyrearten viroid er transskription af viroid RNA’er medieret af værten RNA polymerase II eller for chloroplastic nukleare-kodet RNA polymerase (NEP). Viroid RNA forarbejdning synes at blive katalyseret af et host type III RNase, selvom i viroider med ribozymer oligomere RNA mellemprodukter selvstændige spaltes under replikering. Endelig, de resulterende viroid monomerer er circularized, afhængigt af familien viroid af vært DNA ligase 1 eller den chloroplastic isoform af tRNA ligase^16,17. Denne sidste enzym er involveret i ligatur af de monomere former for viroider i familien Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd)¹⁸.

I løbet af et værk til at analysere sekvens og strukturelle krav til ELVd der bestemmer anerkendelse af aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi oprette en eksperimentel system baseret på fælles udtryk for begge molekyler i E. coli ¹⁹. vi bemærket at længere end enhed ELVd transkripter selv kløver effektivt i E. coli celler gennem integrerede hammerhead ribozymer og at de resulterende viroid monomerer med 5′-hydroxyl og 2′, 3′-phosphodiester termini var effektivt circularized af co udtrykt aubergine tRNA ligase. Endnu mere nået den resulterende cirkulære viroid RNA en uventet høj koncentration i E. coli, overstiger de endogene rRNAs¹². Fravær af replikering mellemprodukter angivet manglende ELVd RNA til RNA forstærkning i disse bakterieceller. Interessant, havde indsættelse af heterolog RNA’er i en bestemt stilling af viroid molekyle en moderat effekt på ophobning af den cirkulære viroid-afledte RNA’er¹². Disse observationer gjort os forestiller en metode til at producere store mængder af rekombinant RNA’er i bakterier. I denne metode, cDNAs svarende til RNA’er af interesse er indsat i ELVd cDNA og den resulterende kimære RNA er udtrykt i E. coli gennem en stærk konstitutive promoter. For at systemet kan fungere, skal E. coli omdannes sammen med et plasmid at udtrykke den aubergine tRNA ligase. ELVd-afledte længere end enhed udskrift er behandlet af integrerede hammerhead ribozymer og de deraf følgende monomerer med de passende termini er anerkendt og circularized af de Co udtrykt tRNA ligase. På denne måde er RNA af interesse indsat i en meget stabil cirkulære stillads bestående af viroid cirkulære molekyle. Denne rekombinant kimære RNA er sandsynligvis yderligere stabiliseret inde i E. coli cellerne ved dannelsen af et komplekst samspil med tRNA ligase ribonucleoprotein. Ved hjælp af denne metode (se protokollen nedenfor), RNA aptamers, hårnål RNA’er og andre strukturerede RNA’er er let produceres i mængder af snesevis af E. coli kultur i regelmæssig laboratorieforhold mg pr. liter og renset til homogenitet tager fordel af cirkularitet¹².

Protocol

1. plasmid konstruktion Forstærke ved PCR (eller reverse transkription PCR hvis start fra en RNA skabelon) cDNA svarende til RNA af interesse ved hjælp af primere med 5′ forlængelse tillade forsamling i udtryk plasmid. For at undgå uønskede mutationer, bruge en high-fidelity DNA polymerase. Hvis du vil indsætte cDNA i udtryk plasmid af Gibson forsamling20, tilføje de følgende 5′ udvidelser til PCR-primere: fremad, 5′-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXX…

Representative Results

For at producere rekombinant RNA i E. coli ved hjælp af ELVd-afledte system12, er RNA af interesse podet ind en ELVd RNA stillads. Denne kimære RNA er co udtrykt langs den aubergine tRNA ligase i E. coli. Når forarbejdet, kløvet og circularized, danner de kimære cirkulært RNA, som stikker RNA af interesse, sandsynligvis en kompleks med co udtrykt aubergine enzymet, der når bemærkelsesværdige koncentration i bakterieceller (<strong class="…

Discussion

Mens forsker ELVd sekvens og struktur krav involveret i anerkendelse af den aubergine tRNA ligase, bemærket vi, at fælles udtryk for begge molekyler i den ikke-vært E. coli førte til en uventet stor ophobning af viroid cirkulære former i bakterieceller¹⁹. Vi forstod, at den store ophobning af viroid RNA i E. coli sandsynligvis var konsekvensen af co udtrykker en yderst stabil RNA-molekyle, som de relativt små (333 nt), stærkt baseret-parret, cirkulær viroid, og et protein…

Materials

Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G