Vi præsenterer her, en protokol til at producere store mængder af rekombinant RNA i Escherichia coli co udtrykke en kimære RNA, der indeholder RNA interesse i en viroid stillads og en plante tRNA ligase. Det vigtigste produkt er en cirkulær molekyle, der letter rensning til ensartethed.
Med stigende interesse i RNA biologi og brugen af RNA molekyler i avancerede bioteknologiske applikationer, er metoder til at producere store mængder af rekombinant RNA’er begrænset. Her, vi beskriver en protokol til at producere store mængder af rekombinant RNA i Escherichia coli baseret på fælles udtryk for en kimære molekyle, der indeholder RNA interesse i en viroid stillads og en plante tRNA ligase. Viroider er relativt små, ikke-kodende, stærkt base-parret cirkulære RNA’er, der er smittefarlige til højere planter. Værten plante tRNA ligase er et enzym, der er ansat af viroider, der tilhører familien Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd), for at mægle RNA circularization under viroid replikering. Selv om ELVd ikke replikerer i E. coli, en ELVd forløber effektivt er transskriberet af E. coli RNA polymerase og behandles af integrerede hammerhead ribozymer i bakterieceller, og de deraf følgende monomerer er circularized af den Co udtrykt tRNA ligase at nå frem til en bemærkelsesværdig koncentration. Indføjelsen af et RNA interesse i ELVd stillads muliggør fremstilling af snesevis af rekombinant RNA pr. liter bakteriekulturen regelmæssig laboratoriegodkendte mg. En vigtigste brøkdel af RNA produkt er cirkulær, en funktion, der letter rensning af af rekombinante RNA til virtuelle homogenitet. I denne protokol, er en supplerende DNA (cDNA) svarende til RNA af interesse indsat i en bestemt stilling af ELVd cDNA i et udtryk plasmidet, som langs plasmid Co udtrykke aubergine tRNA ligase, bruges til at omdanne E. coli. Co udtryk for begge molekyler under kontrol af stærke konstitutiv projektledere fører til produktion af store mængder af af rekombinante RNA. Den rekombinante RNA kan udvindes fra de bakterieceller og adskilt fra hovedparten af bakteriel RNA’er udnytter sin cirkularitet.
I modsætning til DNA og proteiner er protokoller for nem, effektiv og omkostningseffektiv produktion af store mængder af RNA ikke rigelige. Men forskning og industri efterspørgsel stigende mængder af disse biomolekyler at undersøge deres unikke biologiske egenskaber1, eller at være ansat i avancerede bioteknologiske applikationer, herunder deres brug som meget specifikke aptamers 2, terapeutiske agenter3eller selektiv pesticider4. In vitro transskription og kemisk syntese er almindeligt anvendt i forskning til at producere RNA. Men disse metoder indebærer vigtige begrænsninger når store mængder af produkterne, der er påkrævet. Den logiske alternativ er at bruge den endogene transskription maskiner af levende celler, efterfulgt af en rensningsproces at adskille RNA’er af interesse fra den cellulære ledsagere. Efter denne strategi metoder er blevet udviklet til at producere rekombinant RNA’er i bakterieceller, såsom lab-venlige Escherichia coli5 eller den marine lilla fototopiske alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de fleste metoder til at producere rekombinant RNA i bakterier stole på udtryk for en indfødt yderst stabil RNA stillads, såsom en tRNA eller en rRNA, hvor RNA af interesse er indsat7. Dette pålægger nødvendigheden af at frigive RNA af interesse fra de kimære molekyle, hvis tilstedeværelsen af ekstra RNA er et problem for downstream programmer8. Et andet koncept i rekombinant RNA bioteknologi er produktionen af rekombinante ribonucleoprotein komplekser, som kan være den ønskede vare i sig selv eller bruges som en beskyttende strategi til at øge stabiliteten i RNA interesse9, 10. På samme måde, er produktionen af cirkulære RNA’er også blevet foreslået som en strategi til at generere mere stabile produkter11.
Vi har for nylig udviklet en ny metode til at producere store mængder af rekombinant RNA i E. coli , der deltager i tre af de ovennævnte begreber: indsættelse af RNA af interesse i en yderst stabil cirkulært RNA stillads og co udtryk for den rekombinant RNA med en interagerende protein sandsynligvis producere en stabil ribonucleoprotein kompleks, der ophobes i bemærkelsesværdigt beløb i bakteriel celler12. I modsætning til tidligere udvikling brugte vi en RNA stillads helt fremmed for E. coli, nemlig en viroid. Viroider er en meget bestemt type af smitsomme agenser af højere planter, der er udelukkende udgøres af en relativt lille (246-401 nt) meget base-parret cirkulært RNA13. Interessant, viroider ikke-kodende RNA’er, og ingen hjælp fra deres egne proteiner, de er i stand til at fuldføre komplekse smitsomme cykler i inficerede værter14. Disse cyklusser omfatter RNA til RNA replikering i kerner eller grønkorn, afhængigt af familien viroid —Pospiviroidae eller Avsunviroidae, henholdsvis — bevægelse gennem de inficerede anlæg og unddragelse af vært defensive svar. Viroider skal være rangeret blandt de mest stabile RNA’er i naturen, som følge af at være en nøgen cirkulært RNA og skulle overleve i den barske miljø af inficeret planteceller. Denne egenskab kan gøre viroider især velegnet som stilladser til at stabilisere rekombinant RNA i bioteknologiske metoder. Desuden er den nye metode baseret på fælles udtryk for viroid stillads med en interagerende vegetabilske proteiner. Viroider replikere gennem en rullende cirkel mekanisme i hvilken vært enzymer er rekrutteret til at katalysere de forskellige trin i processen. Især nogle viroider, mere konkret dem, der tilhører familien Avsunviroidae15, indeholder ribozymer, der er også involveret i replikation. Dyrearten viroid er transskription af viroid RNA’er medieret af værten RNA polymerase II eller for chloroplastic nukleare-kodet RNA polymerase (NEP). Viroid RNA forarbejdning synes at blive katalyseret af et host type III RNase, selvom i viroider med ribozymer oligomere RNA mellemprodukter selvstændige spaltes under replikering. Endelig, de resulterende viroid monomerer er circularized, afhængigt af familien viroid af vært DNA ligase 1 eller den chloroplastic isoform af tRNA ligase16,17. Denne sidste enzym er involveret i ligatur af de monomere former for viroider i familien Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd)18.
I løbet af et værk til at analysere sekvens og strukturelle krav til ELVd der bestemmer anerkendelse af aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi oprette en eksperimentel system baseret på fælles udtryk for begge molekyler i E. coli 19. vi bemærket at længere end enhed ELVd transkripter selv kløver effektivt i E. coli celler gennem integrerede hammerhead ribozymer og at de resulterende viroid monomerer med 5′-hydroxyl og 2′, 3′-phosphodiester termini var effektivt circularized af co udtrykt aubergine tRNA ligase. Endnu mere nået den resulterende cirkulære viroid RNA en uventet høj koncentration i E. coli, overstiger de endogene rRNAs12. Fravær af replikering mellemprodukter angivet manglende ELVd RNA til RNA forstærkning i disse bakterieceller. Interessant, havde indsættelse af heterolog RNA’er i en bestemt stilling af viroid molekyle en moderat effekt på ophobning af den cirkulære viroid-afledte RNA’er12. Disse observationer gjort os forestiller en metode til at producere store mængder af rekombinant RNA’er i bakterier. I denne metode, cDNAs svarende til RNA’er af interesse er indsat i ELVd cDNA og den resulterende kimære RNA er udtrykt i E. coli gennem en stærk konstitutive promoter. For at systemet kan fungere, skal E. coli omdannes sammen med et plasmid at udtrykke den aubergine tRNA ligase. ELVd-afledte længere end enhed udskrift er behandlet af integrerede hammerhead ribozymer og de deraf følgende monomerer med de passende termini er anerkendt og circularized af de Co udtrykt tRNA ligase. På denne måde er RNA af interesse indsat i en meget stabil cirkulære stillads bestående af viroid cirkulære molekyle. Denne rekombinant kimære RNA er sandsynligvis yderligere stabiliseret inde i E. coli cellerne ved dannelsen af et komplekst samspil med tRNA ligase ribonucleoprotein. Ved hjælp af denne metode (se protokollen nedenfor), RNA aptamers, hårnål RNA’er og andre strukturerede RNA’er er let produceres i mængder af snesevis af E. coli kultur i regelmæssig laboratorieforhold mg pr. liter og renset til homogenitet tager fordel af cirkularitet12.
Mens forsker ELVd sekvens og struktur krav involveret i anerkendelse af den aubergine tRNA ligase, bemærket vi, at fælles udtryk for begge molekyler i den ikke-vært E. coli førte til en uventet stor ophobning af viroid cirkulære former i bakterieceller19. Vi forstod, at den store ophobning af viroid RNA i E. coli sandsynligvis var konsekvensen af co udtrykker en yderst stabil RNA-molekyle, som de relativt små (333 nt), stærkt baseret-parret, cirkulær viroid, og et protein…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud BIO2017-83184-R og BIO2017-91865-EXP fra den spanske Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (samfinansierede FEDER midler).
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |