De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli mede uitspreken een chimeer RNA waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Het hoofdproduct is een circulaire molecuul dat zuivering aan homogeniteit wordt vergemakkelijkt.

Abstract

Met de toenemende belangstelling voor RNA biologie en het gebruik van de molecules van RNA in geavanceerde biotechnologische toepassingen, zijn de methoden voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNAs beperkt. Hier beschrijven we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli gebaseerd op co expressie van een chimeer molecuul waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Viroïden zijn relatief kleine, niet-coderende, zeer base-gepaarde circulaire RNAs die besmettelijk tot hogere planten zijn. De host plant tRNA ligase is een enzym gerekruteerd door viroïden die tot de familie Avsunviroidae, zoals aubergine latente Viroïde (ELVd), behoren om te bemiddelen RNA circularization tijdens Viroïde replicatie. Hoewel ELVd niet gerepliceerd in E. coli, een voorloper van de ELVd is efficiënt getranscribeerd door de E. coli RNA polymerase en verwerkt door de ribozymes van de ingesloten hammerhead in bacteriële cellen, en de resulterende monomeren zijn circularized door de Co uitgedrukt tRNA ligase een opmerkelijke concentratie bereiken. Het inbrengen van een RNA van belang in de ELVd steiger kan de productie van tientallen milligram van de recombinant RNA per liter bacteriecultuur in normale laboratoriumomstandigheden. Een belangrijke fractie van het RNA-product is circulaire, een functie die de reiniging van de recombinante RNA naar virtuele homogeniteit vergemakkelijkt. In dit protocol, wordt een complementaire DNA (cDNA) dat overeenkomt met het RNA van belang ingevoegd in een bepaalde stand van de ELVd cDNA in een plasmide expressie die wordt gebruikt, langs de plasmide uitspreken aubergine tRNA ligase, mede om te transformeren van E. coli. Co expressie van beide moleculen onder de controle van sterke constitutieve initiatiefnemers leidt tot de productie van grote hoeveelheden van de recombinante RNA. De recombinante RNA kan worden geëxtraheerd uit de bacteriële cellen en gescheiden van het merendeel van de bacteriële RNAs profiteren van haar cirkelvormigheid.

Introduction

In tegenstelling tot DNA en proteïnen zijn protocollen voor eenvoudige, efficiënte en rendabele productie van grote hoeveelheden van RNA niet overvloedig. Echter, onderzoek en industrie vraag steeds grotere hoeveelheden van deze biomoleculen te onderzoeken hun unieke biologische eigenschappen¹, of om te worden gebruikt geavanceerde biotechnologische toepassingen, waaronder hun gebruik als zeer specifieke aptamers ², therapeutische agenten³of selectieve pesticiden⁴. In vitro transcriptie en chemische synthese worden vaak gebruikt in onderzoek voor de productie van RNA. Deze methoden leiden echter tot belangrijke beperkingen wanneer grote hoeveelheden van de producten nodig zijn. De logische alternatief is het gebruik van de machines van de endogene transcriptie van levende cellen, gevolgd door een zuiveringsproces te scheiden van de RNAs van belang van de cellulaire metgezellen. Naar aanleiding van deze strategie, zijn methoden ontwikkeld voor de productie van recombinante RNAs in bacteriële cellen, zoals de lab-vriendelijke Escherichia coli⁵ of de marine paarse fototrofe alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum ⁶. de meeste methoden voor de productie van recombinante RNA bij bacteriën is afhankelijk van de expressie van een inheemse zeer stabiele RNA steiger, zoals een tRNA of een rRNA, waarin RNA van belang is ingevoegd⁷. Dit legt de noodzaak van het vrijgeven van het RNA van belang uit het chimeer molecuul, als de aanwezigheid van extra RNA een probleem voor de downstream toepassingen^{8 is}. Een ander concept in recombinant RNA biotechnologie is de productie van recombinante ribonucleoprotein complexen die mogelijk het gewenste product per se of gebruikt als een beschermende strategie om te verhogen de stabiliteit van het RNA van belang^{9, 10}. Ook is de productie van circulaire RNAs ook voorgesteld als een strategie voor het genereren van meer stabiele producten¹¹.

We hebben onlangs een nieuwe methode voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in E. coli die deelneemt aan drie van de bovenstaande concepten ontwikkeld: de invoeging van het RNA van belang in een zeer stabiele cirkelvormige RNA steiger en de co uitdrukking van de recombinante RNA met een interactie eiwit waarschijnlijk tot een stabiele ribonucleoprotein complex dat zich in opmerkelijke bedragen in bacteriële ophoopt cellen¹². In tegenstelling tot eerdere ontwikkelingen gebruikten we een volkomen vreemd is aan E. coli, namelijk een Viroïde RNA-steiger. Viroïden zijn een bijzonder soort infectieuze agentia van hogere planten die zijn uitsluitend gevormd door een relatief klein (246-401 nt) zeer base-gepaarde circulaire RNA¹³. Interessant, viroïden zijn niet-coderende RNAs en met geen hulp van hun eigen eiwitten, ze zijn in staat om het volledige complex besmettelijke cycli in de geïnfecteerde hosts¹⁴. Deze cycli opnemen de replicatie van RNA-RNA-in de kernen of chloroplasten, afhankelijk van de familie Viroïde —Pospiviroidae of Avsunviroidae, respectievelijk — verkeer via de besmette plant en -ontduiking van de defensieve reactie van de gastheer. Viroïden moeten worden gerangschikt onder de meest stabiele RNAs in de natuur, als gevolg van een naakte circulaire RNA en om te overleven in de vijandige omgeving van plantencellen besmet. Deze eigenschap kan maken viroïden bijzonder geschikt als steigers te stabiliseren recombinant RNA in biotechnologische benaderingen. Bovendien is de nieuwe methode gebaseerd op co uitdrukking van de Viroïde steiger met een interactie plantaardige eiwitten. Viroïden gerepliceerd via een mechanisme van de rolling-circle in welke host enzymen zijn gerekruteerd om te katalyseren van de verschillende stappen van het proces. Met name sommige viroïden, meer in het bijzonder degenen die tot de familie Avsunviroidae^{15 behoren}, bevatten ribozymes die ook bij de replicatie zijn betrokken. Afhankelijk van de soort Viroïde, is transcriptie van Viroïde RNAs gemedieerd door de host RNA polymerase II of de chloroplastic nucleaire-gecodeerd RNA polymerase (NEP). Viroïde RNA verwerking lijkt te worden gekatalyseerd door een host type III RNase, hoewel in viroïden met ribozymes oligomere RNA tussenproducten zelf tijdens de replicatie klieven. Tot slot, de resulterende Viroïde monomeren zijn circularized, afhankelijk van de familie Viroïde door de host DNA ligase 1 of de chloroplastic isovorm van tRNA ligase^16,17. Dit laatste enzym is betrokken bij Afbinding van de monomere vormen van de viroïden in de familie Avsunviroidae, zoals aubergine latente Viroïde (ELVd)¹⁸.

In de loop van een werk voor het analyseren van de volgorde en de structurele eisen van ELVd die bepalen van erkenning door de aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, wij stellen een experimenteel systeem gebaseerd op co expressie van beide moleculen in E. coli ¹⁹. Wij merkten dat langer-dan-unit ELVd afschriften zelf efficiënt in E. coli cellen via de ingesloten hammerhead ribozymes klieven en dat de resulterende Viroïde monomeren met 5′-hydroxyl en 2′, 3′-phosphodiester termini efficiënt circularized door de mede uitgedrukt aubergine tRNA ligase. Sterker nog, bereikt de resulterende circulaire Viroïde RNA een onverwachte hoge concentraties in E. coli, dan die van de endogene rRNAs¹². Afwezigheid van replicatie tussenproducten aangegeven gebrek ELVd RNA-RNA-amplificatie in deze bacteriële cellen. Interessant, had invoeging van heterologe RNAs in een bepaalde stand van het molecuul Viroïde een matig effect op de accumulatie van de circulaire Viroïde afkomstige RNAs¹². Deze opmerkingen maakte ons voorzien van een methode om grote hoeveelheden recombinant RNAs in bacteriën produceren. Bij deze methode wordt de cDNAs overeenkomt met de RNAs van belang worden ingevoegd in de cDNA ELVd en de resulterende chimeer RNA wordt uitgedrukt in E. coli via een sterke constitutieve promotor. Voor het systeem te werken, moet de E. coli samen met een plasmide wil de aubergine tRNA ligase worden omgevormd. Het langer-dan-unit ELVd-afgeleide transcript is verwerkt door de ingesloten hammerhead ribozymes en de resulterende monomeren met de juiste termini zijn erkend en circularized door de mede uitgedrukt tRNA ligase. Op deze manier is de RNA van belang een zeer stabiele cirkelvormige steiger bestaande uit het Viroïde circulaire molecuul ingevoegd. Deze recombinante chimeer RNA is waarschijnlijk verder gestabiliseerd in de cellen van E. coli door vorming van een complexe door interactie met tRNA ligase ribonucleoprotein. Met behulp van deze methode (zie protocol hieronder), RNA aptamers, haarspeld RNAs en andere gestructureerde RNAs zijn gemakkelijk geproduceerd in hoeveelheden van tientallen milligram per liter voor E. coli cultuur in normale laboratoriumomstandigheden en gezuiverd tot homogeniteit nemen voordeel van cirkelvormigheid¹².

Protocol

1. plasmide bouw Versterken door PCR (of omgekeerde transcriptie PCR als vanaf een sjabloon van RNA) overeenkomt met de RNA van belang gebruikend inleidingen met 5′ extensie toe vergadering in de expressie plasmide cDNA. Om te voorkomen dat ongewenste mutaties, gebruikt u een hifi-polymerase van DNA. Als u wilt invoegen de cDNA in het plasmide expressie door Gibson vergadering20, de volgende 5′ extensies toevoegen aan de PCR inleidingen: forward, 5′-tctccccct…

Representative Results

Het RNA van belang is voor de productie van recombinant RNA in E. coli met behulp van de ELVd-afgeleide systeem12, een steiger ELVd RNA geënt. Deze chimeer RNA is mede uitgedrukt langs de aubergine tRNA ligase in E. coli. Zodra verwerkt, gekloofd en circularized, vormt het chimeer circulaire RNA, waaruit de RNA van belang steekt, waarschijnlijk een complex met de mede uitgedrukt aubergine enzym dat opmerkelijke concentratie in de bacteriële cell…

Discussion

Hoewel het onderzoek naar de ELVd volgorde en structuur eisen die betrokken zijn bij de erkenning door de aubergine tRNA ligase, merkten we dat mede expressie van beide moleculen in de niet-host E. coli leidde tot een onverwachte grote opeenstapeling van Viroïde circulaire formulieren in bacteriecellen¹⁹. We begrepen dat de grote opeenstapeling van Viroïde RNA in E. coli waarschijnlijk het gevolg was van mede uiting van een zeer stabiele RNA-molecuul, zoals de relatief kleine (…

Materials

Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G