Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um produzieren große Mengen an rekombinanten RNA in Escherichia coli Co zum Ausdruck bringen, eine Chimäre RNA, die die RNA in ein Viroid-Gerüst und eine Pflanze enthält tRNA-Ligase. Das Hauptprodukt ist ein kreisförmigen Molekül, das erleichtert die Reinigung zur Homogenität.

Abstract

Mit zunehmendem Interesse an RNA Biology und die Verwendung von RNA-Molekülen in anspruchsvolle biotechnologische Anwendungen, sind die Methoden, um große Mengen von rekombinanten RNAs produzieren beschränkt. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um produzieren große Mengen an rekombinanten RNA in Escherichia coli basierend auf Co Ausdruck eines Chimären Moleküls, die die RNA in ein Viroid-Gerüst und eine Pflanze enthält tRNA-Ligase. Viroide sind relativ klein, nicht-kodierenden, hoch Basis gepaart kreisförmige RNAs, die ansteckend für höhere Pflanzen sind. Der Host Pflanzen tRNA Ligase ist ein Enzym rekrutiert durch Viroide, die zu der Familie Avsunviroidae, wie z. B. Auberginen latente Viroid (ELVd) gehören, um RNA-Circularization während der Viroid-Replikation zu vermitteln. Obwohl ELVd nicht in E. Coli repliziert, eine ELVd Vorläufer ist effizient durch die E. Coli -RNA-Polymerase transkribiert und verarbeitet durch die eingebetteten Hammerhai Ribozyme in Bakterienzellen und die daraus resultierende Monomere durch circularized sind die Co zum Ausdruck gebrachten tRNA-Ligase eine bemerkenswerte Konzentration zu erreichen. Das Einfügen einer RNA von Interesse in der ELVd Gerüst ermöglicht die Produktion von zehn Milligramm des rekombinanten RNA pro Liter Bakterienkultur unter normalen Laborbedingungen. Eine Hauptfraktion des RNA-Produkts ist kreisförmig, ein Feature, das erleichtert die Reinigung der rekombinanten RNA zur virtuellen Homogenität. In diesem Protokoll wird die eine komplementäre DNA (cDNA) entsprechend der RNS des Interesses an einer bestimmten Position ELVd cDNA in ein Expressionsplasmid eingefügt, die entlang das Plasmid Aubergine tRNA Ligase Co Ausdrücken verwendet wird, um E. Colizu verwandeln. Co Ausdruck der beiden Moleküle unter der Kontrolle der starken konstitutiven Promoter führt zur Produktion von großen Mengen der rekombinanten RNA. Rekombinante RNA kann der bakteriellen Zellen entnommen und getrennt von der Masse der bakteriellen RNAs unter Ausnutzung seiner Zirkularität.

Introduction

Im Gegensatz zu DNA und Proteine sind Protokolle für einfache, effiziente und kostengünstige Produktion von großen Mengen an RNA nicht reichlich vorhanden. Jedoch anspruchsvolle Forschung und Industrie verlangen immer mehr diese Biomoleküle ihre einzigartigen biologischen Eigenschaften¹zu untersuchen oder eingesetzt werden biotechnologische Anwendungen, einschließlich ihrer Verwendung als hochspezifische Aptameren ², Therapeutika³oder selektive Schädlingsbekämpfungsmittel⁴. In vitro Transkription und chemische Synthese werden häufig in der Forschung verwendet, um RNA zu produzieren. Jedoch führen diese Methoden wichtige Einschränkungen, wenn große Mengen der Produkte erforderlich sind. Die logische Alternative ist mit den endogenen Transkriptionsmaschinerie lebender Zellen, gefolgt von einen Reinigungsprozess, der RNAs von Interesse von den zellulären Begleitern zu trennen. Nach dieser Strategie wurden Methoden entwickelt, um rekombinante RNAs in Bakterienzellen, wie z. B. der Lab-freundlich zu produzieren Escherichia coli⁵ oder die marine lila phototrophe Alpha-Proteobakterium Rhodovolum Sulfidophilum ⁶. rekombinanter RNA in Bakterien produzieren die meisten Methoden setzen auf die Expression von native hochstabile RNA leski, wie z. B. eine tRNA oder einer rRNA, in denen die RNS von Interesse ist⁷eingefügt. Damit steigen die Notwendigkeit des Freigebens der RNS von Interesse aus der Chimären Moleküls, wenn das Vorhandensein von zusätzlichen RNA ein Problem für die downstream-Anwendungen-^{8 ist}. Ein weiteres Konzept in rekombinanter RNA Biotechnologie ist die Produktion von rekombinanten Ribonucleoprotein-komplexe, die können das gewünschte Produkt per se oder verwendet als schützende Strategie zur Erhöhung der Stabilität der RNA des Interesse^{9, 10}. Ebenso wurde die Produktion von kreisförmigen RNAs auch als Strategie zur stabileren Produkte¹¹generieren vorgeschlagen.

Vor kurzem haben wir eine neue Methode, um große Mengen von rekombinanten RNA in E. Coli zu produzieren, die in drei der oben genannten Konzepte beteiligt ist: das Einfügen von der RNA von Interesse in eine hochstabile zirkuläre RNA-Gerüst und Co Ausdruck der rekombinante RNA mit einer interagierenden Proteins, wahrscheinlich eine stabile Ribonucleoprotein Komplex zu produzieren, die sammelt sich in beachtlichen Mengen in bakterielle Zellen¹². Im Gegensatz zu den bisherigen Entwicklungen verwendeten wir eine RNA-Gerüst E. Coli, nämlich ein Viroid völlig fremd. Viroide sind eine ganz besondere Art von Infektionserregern von höheren Pflanzen, die ausschließlich durch eine relativ kleine (246-401 nt) konstituiert sind höchst Basis gepaart kreisförmige RNA¹³. Interessanterweise Viroide sind nicht-kodierende RNAs und ohne Hilfe von ihren eigenen Proteine können sie komplexe infektiöse Zyklen in den infizierten Hosts¹⁴abschließen. Diese Zyklen sind die RNA-RNA-Replikation in die Zellkerne oder Chloroplasten, abhängig von der Viroid-Familie –Pospiviroidae oder Avsunviroidae, bzw. – Bewegung durch die infizierten Pflanze und Umgehung der defensive Wirtsantwort. Viroide müssen unter der stabilste RNAs in der Natur, als Folge eine nackte Runde RNA und Überleben in der feindlichen Umgebung von Pflanzenzellen infiziert eingestuft werden. Diese Eigenschaft kann Viroide als Gerüste, rekombinante RNA in biotechnologischen Ansätzen zu stabilisieren besonders geeignet machen. Darüber hinaus basiert die neue Methode auf Co Ausdruck die Viroid-Gerüst mit einer interagierenden pflanzlichem Eiweiß. Viroide replizieren durch einen rolling-Circle-Mechanismus in welchem, den Host Enzyme rekrutiert werden, um die verschiedenen Schritte des Prozesses zu katalysieren. Insbesondere einige Viroide, genauer gesagt diejenigen, die zu der Familie Avsunviroidae¹⁵, gehören enthalten Ribozyme, die auch bei der Replikation beteiligt sind. Je nach Tierart Viroid wird vom Host RNA-Polymerase II oder die chloroplastic-nuklearen codiert-RNA-Polymerase (NEP) Transkription von Viroid-RNAs vermittelt. Viroid-RNA Verarbeitung scheint von einem Host katalysiert werden Typ-III-RNase, obwohl in Viroide mit Ribozyme Oligomere RNA Zwischenprodukte während der Replikation selbst Spalten. Schließlich sind die daraus resultierenden Viroid-Monomere, abhängig von der Viroid-Familie durch die Host-DNA-Ligase 1 oder chloroplastic Isoform der tRNA-Ligase^16,17circularized. Dieses letzte Enzym ist Ligatur der Monomeren Formen der Viroide in der Familie Avsunviroidae, wie z. B. Auberginen latente Viroid (ELVd)¹⁸beteiligt.

Im Zuge eines Werkes, die Sequenz und strukturellen Anforderungen der ELVd zu analysieren, die Anerkennung durch die Aubergine (Solanum Melongena L.) bestimmen tRNA-Ligase, wir richten Sie ein experimentelles System basierend auf Co Ausdruck der beiden Moleküle in E. Coli ¹⁹. Wir haben festgestellt, dass länger als Einheit ELVd Protokolle effizient in E. Coli Zellen durch die eingebetteten Hammerhai Ribozyme selbst zu Spalten und den daraus resultierenden Viroid Monomeren mit 5′-Hydroxyl und 2′, 3′-Phosphodiester-Termini wurden effizient circularized durch die Zusammenarbeit zum Ausdruck gebrachten Aubergine tRNA-Ligase. Noch mehr erreicht die resultierende kreisförmige Viroid-RNA eine unerwartete hohe Konzentration in E. Coli, über denen der endogenen rRNAs¹². Abwesenheit von Replikation Zwischenprodukten angegeben Mangel ELVd RNA-RNA Amplifikation in diesen bakteriellen Zellen. Interessanterweise hatten die Einfügung der heterologen RNAs in einer bestimmten Position des Moleküls Viroid eine moderate Wirkung auf Anhäufung der kreisförmigen Viroid-abgeleitete RNAs¹². Diese Beobachtungen machte uns vorstellen, eine Methode, um große Mengen von rekombinanten RNAs in Bakterien produzieren. Bei dieser Methode die cDNAs entspricht der RNAs von Interesse sind in der ELVd cDNA eingefügt und die daraus resultierende Chimäre RNA drückt sich in E. Coli durch einen starken konstitutiven Promoter. Damit das System funktioniert muss E. Coli mit einem Plasmid, die Auberginen tRNA-Ligase auszudrücken Co umgewandelt werden. ELVd abgeleitet länger als Einheit Transkript wird durch die eingebetteten Hammerhai Ribozyme verarbeitet und die daraus resultierende Monomere mit den entsprechenden Termini werden erkannt und circularized durch die Zusammenarbeit zum Ausdruck gebrachten tRNA-Ligase. Auf diese Weise wird die RNA von Interesse in eine sehr stabil kreisförmige Gerüst bestehend aus das Viroid kreisförmigen Molekül eingefügt. Diese rekombinanten Chimären RNA ist höchstwahrscheinlich weiter innerhalb der E. Coli -Zellen durch Bildung von ein Ribonucleoprotein durch Interaktion mit tRNA-Ligase Komplex stabilisiert. Mit dieser Methode (siehe Protokoll unten), RNA Aptameren, Haarnadel RNAs und andere strukturierte RNAs leicht in Mengen von 10 Milligramm pro Liter des E. Coli -Kultur unter normalen Laborbedingungen hergestellt und zur Einnahme von Homogenität gereinigt Vorteil der Zirkularität¹².

Protocol

(1) Plasmid Bau Durch PCR (oder durch reverse Transkription PCR, wenn ausgehend von einer RNA-Vorlage) verstärken die cDNA entspricht der RNS mit Primer mit 5′ Extension zum Einbau in das Expressionsplasmid zu ermöglichen. Verwenden Sie zur Vermeidung von unerwünschten Mutationen ein High-Fidelity-DNA-Polymerase. Die folgenden 5′ Erweiterungen hinzufügen um die cDNA von Gibson Montage20in das Expressionsplasmid einfügen, die PCR-Primer: vorwärts, 5′-Tct…

Representative Results

Zur Herstellung rekombinanter RNA in E. Coli mit ELVd abgeleitete System12ist die RNA von Interesse in eine ELVd RNA-Gerüst veredelt. Diese Chimären RNA ist Co ausgedrückt entlang der Aubergine tRNA-Ligase in E. Coli. Nach der Bearbeitung, gespalten und circularized, bildet die Chimäre kreisförmige RNA, aus der RNA des Interesses ragt, wahrscheinlich ein Ribonucleoprotein Komplex mit dem Co ausgedrückt Aubergine Enzym, das bemerkenswerte Kon…

Discussion

Bei der Recherche die ELVd Sequenz und Strukturanforderungen an die Anerkennung durch die Auberginen tRNA-Ligase beteiligt, bemerkten wir, dass Co Ausdruck der beiden Moleküle in nicht-Host E. Coli führte zu einer unerwarteten großen Anhäufung von Viroid kreisförmige Formen in Bakterienzellen¹⁹. Wir verstanden, dass die große Ansammlung von Viroid-RNA in E. Coli sehr wahrscheinlich die Folge Co auszudrücken ein hochstabiles RNA-Molekül, wie die relativ kleinen (333 nt), h…

Materials

Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G