एक परिपत्र पाड़ पर रिकॉमबिनेंट RNAs के बड़े पैमाने पर उत्पादन ई कोलाई में एक Viroid-व्युत्पन्न प्रणाली का उपयोग
Summary
यहाँ, हम एक viroid पाड़ और एक संयंत्र tRNA ligase में ब्याज की आरएनए शामिल है कि सह-व्यक्त एक chimeric आरएनए के द्वारा ई कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं. मुख्य उत्पाद एक परिपत्र अणु कि सजातीयता को शुद्धीकरण की सुविधा है ।
Abstract
आरएनए जीव विज्ञान और परिष्कृत जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में आरएनए अणुओं के उपयोग में बढ़ती रुचि के साथ, रिकॉमबिनेंट RNAs की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के तरीके सीमित हैं । यहां, हम एक viroid पाड़ और एक संयंत्र tRNA ligase में ब्याज की आरएनए शामिल है कि एक chimeric अणु की सह अभिव्यक्ति पर आधारित ई कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । Viroids अपेक्षाकृत छोटे हैं, गैर कोडिंग, उच्च आधार युग्मित परिपत्र RNAs है कि अधिक पौधों के लिए संक्रामक हैं । मेजबान संयंत्र tRNA ligase एक viroids है कि परिवार Avsunviroidae, जैसे बैंगन अव्यक्त viroid (ELVd), circularization पुनरावृत्ति के दौरान आरएनए viroid मध्यस्थता करने के लिए संबंधित द्वारा भर्ती एंजाइम है । हालांकि ELVd ई. कोलाई, एक ELVd अग्रदूत में दोहराने नहीं है कुशलतापूर्वक ई. कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा लिखित और बैक्टीरियल कोशिकाओं में एम्बेडेड हथौड़ा ribozymes द्वारा संसाधित है, और परिणामस्वरूप मोनोमर द्वारा परिपत्र सह-व्यक्त tRNA ligase एक उल्लेखनीय एकाग्रता तक पहुँचने. ELVd पाड़ में ब्याज की एक आरएनए के सम्मिलन नियमित प्रयोगशाला की स्थिति में बैक्टीरियल संस्कृति के प्रति लीटर रिकॉमबिनेंट आरएनए के मिलीग्राम के उत्पादन में सक्षम बनाता है. आरएनए उत्पाद का एक मुख्य अंश परिपत्र, एक विशेषता है कि आभासी सजातीयता को रिकॉमबिनेंट आरएनए की शुद्धि की सुविधा है । इस प्रोटोकॉल में, एक पूरक डीएनए (सीडीएनए) ब्याज की आरएनए के लिए इसी ELVd सीडीएनए की एक विशेष स्थिति में एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड है कि प्रयोग किया जाता है में डाला जाता है, प्लाज्मिड के साथ सह एक्सप्रेस बैंगन tRNA ligase, ई. कोलाईको बदलने के लिए । मजबूत गठित प्रवर्तकों के नियंत्रण में दोनों अणुओं की सह-अभिव्यक्ति रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा के उत्पादन की ओर ले जाती है । रिकॉमबिनेंट आरएनए को बैक्टीरियल कोशिकाओं से निकाला जा सकता है और इसके प्रचलन का लाभ उठाते हुए बैक्टीरियल RNAs के थोक से अलग कर दिया जाता है.
Introduction
डीएनए और प्रोटीन के विपरीत, आरएनए की बड़ी मात्रा में आसान, कुशल और लागत प्रभावी उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल प्रचुर मात्रा में नहीं हैं । हालांकि, अनुसंधान और उद्योग इन जैव अणुओं की मात्रा में वृद्धि की मांग उनके अद्वितीय जैविक1संपत्तियों की जांच करने के लिए, या अत्यधिक विशिष्ट aptamers के रूप में उनके उपयोग सहित परिष्कृत प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में कार्यरत हो 2, चिकित्सकीय एजेंटों3, या चयनात्मक कीटनाशकों4। इन विट्रो में प्रतिलेखन और रासायनिक संश्लेषण आमतौर पर आरएनए का उत्पादन करने के लिए अनुसंधान में इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, इन पद्धतियों महत्वपूर्ण सीमाओं जब उत्पादों की बड़ी मात्रा में आवश्यक है जोर । तार्किक विकल्प के लिए जीवित कोशिकाओं की अंतर्जात प्रतिलेखन मशीनरी का उपयोग करने के लिए है, एक शुद्धि प्रक्रिया के बाद सेलुलर साथी से ब्याज की RNAs अलग करने के लिए । इस रणनीति के बाद, तरीकों को बैक्टीरियल कोशिकाओं में रिकॉमबिनेंट RNAs उत्पादन के लिए विकसित किया गया है, इस तरह के रूप में प्रयोगशाला के अनुकूल ई कोलाई5 या समुद्री बैंगनी phototrophic अल्फा-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. बैक्टीरिया में रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन करने के लिए सबसे अधिक तरीके एक देशी अत्यधिक स्थिर आरएनए पाड़ की अभिव्यक्ति पर निर्भर करते हैं, जैसे कि एक tRNA या एक rRNA, जिसमें ब्याज की आरएनए7डाला जाता है. इस chimeric अणु से बाहर ब्याज की आरएनए जारी की आवश्यकता लगाता है, अगर अतिरिक्त आरएनए की उपस्थिति के बहाव अनुप्रयोगों के लिए एक समस्या है8. रिकॉमबिनेंट आरएनए जैव प्रौद्योगिकी में एक और अवधारणा रिकॉमबिनेंट ribonucleoprotein कॉम्प्लेक्स है कि प्रति वांछित उत्पाद हो सकता है या ब्याज9की आरएनए की स्थिरता को बढ़ाने के लिए एक सुरक्षात्मक रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया का उत्पादन है, 10. इसी तरह, परिपत्र RNAs के उत्पादन में भी अधिक स्थिर उत्पाद पैदा करने के लिए एक रणनीति के रूप में सुझाव दिया गया है11.
हम हाल ही में एक नई विधि के लिए ई. कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए कि उपर्युक्त अवधारणाओं के तीन में भाग लेने में बड़ी मात्रा में उत्पादन विकसित किया है: एक अत्यंत स्थिर परिपत्र आरएनए पाड़ में ब्याज की आरएनए के सम्मिलन और सह की अभिव्यक्ति एक बातचीत प्रोटीन के साथ रिकॉमबिनेंट आरएनए की संभावना एक स्थिर ribonucleoprotein जटिल है कि जीवाणु कोशिकाओं में उल्लेखनीय मात्रा में जमा12का उत्पादन. पिछले घटनाक्रम के विपरीत, हम एक आरएनए पाड़ पूरी तरह से ई. कोलाई, अर्थात् एक viroid के लिए विदेशी इस्तेमाल किया । Viroids उच्च संयंत्रों के संक्रामक एजेंटों का एक बहुत ही विशेष प्रकार है कि विशेष रूप से एक अपेक्षाकृत छोटे द्वारा गठित कर रहे है (246-401 nt) अत्यधिक आधार युग्मित आरएनए13। दिलचस्प है, viroids गैर कोडिंग RNAs है और अपने स्वयं के प्रोटीन से कोई मदद के साथ, वे संक्रमित14में जटिल संक्रामक चक्र को पूरा करने में सक्षम हैं । इन चक्रों में आरएनए-टू-आरएनए प्रतिकृति नाभिक या chloroplasts, viroid परिवार पर निर्भर करता है —Pospiviroidae या Avsunviroidae, क्रमशः-संक्रमित संयंत्र और मेजबान रक्षात्मक प्रतिक्रिया की चोरी के माध्यम से आंदोलन शामिल हैं । Viroids प्रकृति में सबसे स्थिर RNAs के बीच क्रमित किया जाना चाहिए, एक नग्न परिपत्र आरएनए होने का एक परिणाम के रूप में और संयंत्र संक्रमित कोशिकाओं के शत्रुतापूर्ण वातावरण में जीवित रहने के लिए होने. इस संपत्ति viroids विशेष रूप से उपयुक्त पाड़ों के रूप में रिकॉमबिनेंट आरएनए के लिए प्रौद्योगिकी के दृष्टिकोण में स्थिर कर सकते हैं । इसके अलावा, नई विधि सह पर आधारित है एक बातचीत संयंत्र प्रोटीन के साथ viroid पाड़ की अभिव्यक्ति । Viroids एक रोलिंग सर्किल तंत्र जिसमें मेजबान एंजाइमों की प्रक्रिया के विभिंन चरणों उत्प्रेरित भर्ती कर रहे है के माध्यम से दोहराने । विशेष रूप से कुछ viroids, अधिक विशेष रूप से उन है कि परिवार Avsunviroidae15से संबंधित हैं, ribozymes भी है कि प्रतिकृति में शामिल हैं । viroid प्रजातियों पर निर्भर करता है, viroid RNAs की प्रतिलिपि मेजबान आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय या chloroplastic परमाणु इनकोडिंग आरएनए पोलीमरेज़ (नेप) द्वारा मध्यस्थता है. Viroid आरएनए प्रोसेसिंग एक मेजबान प्रकार-III RNase द्वारा catalyzed लगता है, हालांकि ribozymes oligomeric आरएनए मध्यवर्ती के साथ viroids में प्रतिकृति के दौरान स्व-सट. अंत में, परिणामस्वरूप viroid मोनोमर, viroid परिवार के आधार पर, मेजबान डीएनए ligase 1 या chloroplastic isoform16,17के tRNA ligase द्वारा परिपत्रित हैं । यह आखिरी एंजाइम परिवार Avsunviroidaeमें viroids के monomeric रूपों के बंधाव में शामिल है, जैसे बैंगन उनक viroid (ELVd)18.
एक काम के दौरान अनुक्रम और ELVd कि बैंगन (मकोय melongena एल) tRNA ligase द्वारा मांयता निर्धारित की संरचनात्मक आवश्यकताओं का विश्लेषण करने के लिए, हम एक प्रयोगात्मक सह पर आधारित प्रणाली की स्थापना की ई. कोलाई में दोनों अणुओं की अभिव्यक्ति 19. हमने देखा है कि अब से अधिक इकाई ELVd टेप स्वयं-कुशलतापूर्वक ई. कोलाई कोशिकाओं में एंबेडेड हथौड़ा ribozymes के माध्यम से और है कि जिसके परिणामस्वरूप viroid मोनोमर के साथ 5 ‘-हाइड्रॉक्सिल और 2 ‘, 3 ‘-phosphodiester टर्मिनी थे कुशलतापूर्वक सह-व्यक्त बैंगन tRNA ligase द्वारा परिपत्र । इससे भी अधिक, परिणामस्वरूप परिपत्र viroid आरएनए ई. कोलाईमें एक अप्रत्याशित उच्च एकाग्रता तक पहुँच, अंतर्जात rRNAs12के उन से अधिक. प्रतिकृति मध्यवर्ती की अनुपस्थिति इन बैक्टीरियल कोशिकाओं में ELVd आरएनए-टू-आरएनए प्रवर्धन की कमी संकेत दिया । दिलचस्प है, viroid अणु की एक विशेष स्थिति में heterologous RNAs की प्रविष्टि परिपत्र viroid के संचय पर एक उदारवादी प्रभाव था-RNAs12व्युत्पंन । इन टिप्पणियों ने हमें बैक्टीरिया में रिकॉमबिनेंट RNAs की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने के लिए एक विधि की कल्पना की । इस विधि में, ब्याज की RNAs के लिए इसी cDNAs ELVd सीडीएनए में डाला जाता है और परिणामस्वरूप chimeric आरएनए ई. कोलाई में एक मजबूत गठन प्रमोटर के माध्यम से व्यक्त किया जाता है । काम करने के लिए प्रणाली के लिए, ई. कोलाई सह होना चाहिए एक प्लाज्मिड के साथ परिवर्तित करने के लिए बैंगन tRNA ligase व्यक्त करते हैं । ELVd-प्राप्त अब से अधिक इकाई प्रतिलिपि एंबेडेड हथौड़ा ribozymes द्वारा संसाधित है और उचित टर्मिनी के साथ जिसके परिणामस्वरूप मोनोमर मांयता प्राप्त कर रहे है और सह द्वारा परिपत्र tRNA ligase व्यक्त की है । इस तरह, ब्याज की आरएनए viroid परिपत्र अणु से मिलकर एक बहुत स्थिर परिपत्र पाड़ में डाला जाता है । इस रिकॉमबिनेंट chimeric आरएनए सबसे शायद आगे tRNA ligase के साथ बातचीत के माध्यम से एक ribonucleoprotein परिसर के गठन के द्वारा ई. कोलाई कोशिकाओं के अंदर स्थिर है । इस विधि का प्रयोग (नीचे प्रोटोकॉल देखें), आरएनए aptamers, hairpin RNAs और अन्य संरचित RNAs आसानी से ई. कोलाई संस्कृति की प्रति लीटर की मात्रा में उत्पादन किया गया है नियमित रूप से प्रयोगशाला की स्थितियों में और सजातीयता को ले शुद्ध परिपत्र का लाभ12.
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि ELVd अनुक्रम और संरचना बैंगन tRNA ligase द्वारा मांयता में शामिल आवश्यकताओं शोध, हमने देखा है कि सह गैर में दोनों अणुओं की अभिव्यक्ति-मेजबान ई. कोलाई viroid परिपत्र के एक अप्रत्याशित बड़े संचय के लिए नेतृत्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था 2017-83184-R और 91865-EXP से स्पेनी Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (सह वित्त पोषित FEDER फंड).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
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