Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli co-esprimendo un RNA chimerico che contiene il RNA di interesse in un’impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Il prodotto principale è una molecola circolare che facilita la purificazione di omogeneità.
Abstract
Con il crescente interesse per la biologia del RNA e l’impiego di molecole di RNA in sofisticate applicazioni biotecnologiche, i metodi per produrre grandi quantità di RNA ricombinante sono limitati. Qui, descriviamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli basato su co-espressione di una molecola chimerica che contiene il RNA di interesse in un’impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Viroidi sono relativamente piccole, non codificanti, altamente abbinati in base RNAs circolari che sono infettivi per piante superiori. L’host pianta tRNA ligasi è un enzima reclutato da viroidi che appartengono alla famiglia Avsunviroidae, quali melanzane viroid latente (ELVd), per mediare circularization di RNA durante la replica di viroide. Anche se ELVd non replica in Escherichia coli, un precursore di ELVd è efficientemente trascritti dalla RNA polimerasi Escherichia coli ed elaborato dai ribozimi hammerhead incorporato nelle cellule batteriche e i monomeri risultanti sono circolarizzazione della co-espressi ligasi di tRNA raggiungendo una notevole concentrazione. L’inserimento di un RNA di interesse in patibolo ELVd consente la produzione di decine di milligrammi di RNA ricombinante per litro di coltura batterica in condizioni normali di laboratorio. Una frazione principale del prodotto RNA è circolare, una caratteristica che facilita la purificazione del RNA ricombinante ad omogeneità virtuale. In questo protocollo, un corrispondente di DNA (cDNA) complementare al RNA di interesse viene inserito in una particolare posizione del cDNA ELVd in un plasmide di espressione che viene utilizzata, lungo il plasmide per co-esprimere melanzana-ligasi tRNA per trasformare e. coli. Co-espressione di entrambe le molecole sotto il controllo di promotori costitutivi forti porta alla produzione di grandi quantità di RNA ricombinante. il RNA ricombinante può essere Estratto da cellule batteriche e separato dalla massa di RNA batterico, approfittando della sua circolarità.
Introduction
A differenza del DNA e proteine, protocolli per la produzione di semplice, efficiente ed economica di grandi quantità di RNA non sono abbondanti. Tuttavia, ricerca e industria domanda quantità crescenti di queste biomolecole per studiare le loro proprietà biologiche uniche1, o per essere impiegati in sofisticate applicazioni biotecnologiche, tra cui il loro uso come aptameri altamente specifico 2, agenti terapeutici3o pesticidi selettiva4. Sintesi chimica e trascrizione in vitro sono comunemente usati nella ricerca per produrre RNA. Tuttavia, questi metodi comportano limitazioni importanti quando grandi quantità di prodotti sono richiesti. La logica alternativa consiste nell’utilizzare i macchinari di trascrizione endogena delle cellule viventi, seguita da un processo di purificazione per separare il RNA di interesse dai compagni cellulari. Seguendo questa strategia, sono stati sviluppati metodi per produrre RNA ricombinante in cellule batteriche, quali il laboratorio-friendly Escherichia coli5 o la Marina viola phototrophic alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. maggior parte dei metodi per produrre RNA ricombinante nei batteri si basano sull’espressione di un’impalcatura nativa di RNA altamente stabile, come un tRNA o un rRNA, in cui il RNA di interesse è inserito7. Questo impone la necessità di liberare il RNA di interesse fuori la molecola chimerica, se la presenza di RNA supplementare è un problema per le applicazioni a valle8. Un altro concetto a ricombinante biotecnologie RNA è la produzione di complessi della ribonucleoproteina ricombinante che può essere il prodotto desiderato per sé o utilizzato come una strategia di protezione per aumentare la stabilità del RNA di interesse9, 10. Analogamente, la produzione di RNA circolare inoltre è stata suggerita come una strategia per generare più stabile prodotti11.
Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in e. coli che partecipa a tre dei concetti qui sopra: l’inserimento di RNA di interesse in un’impalcatura di RNA circolare altamente stabile e la co-espressione della RNA ricombinante con una proteina d’interazione probabile produrre una ribonucleoproteina stabile complessa che si accumula in quantità notevole in batterico cellule12. In contrasto con sviluppi precedenti, abbiamo usato un’impalcatura di RNA completamente estraneo ad e. coli, vale a dire un viroide. Viroidi sono un tipo molto particolare di agenti infettivi di più alte piante che sono costituite esclusivamente da un relativamente piccolo (246-401 nt) altamente abbinati in base circolare RNA13. Interessante, viroidi sono RNA non codificanti e, senza alcun aiuto di proprie proteine, sono in grado di completare cicli complessi infettive nel host infetti14. Questi cicli includono la replica di RNA-a-RNA nei nuclei o cloroplasti, a seconda della famiglia di viroide —Pospiviroidae o Avsunviroidae, rispettivamente — movimento attraverso la pianta infetta e l’evasione della risposta difensiva ospite. Viroidi devono essere allineati fra il RNAs più stabile in natura, come conseguenza di essere un RNA circolare nudo e dover sopravvivere in un ambiente ostile di cellule vegetali infetti. Questa proprietà può rendere particolarmente adatto come scaffold per stabilizzare ricombinante RNA in approcci biotecnologici viroidi. Inoltre, il nuovo metodo si basa sulla co-espressione dell’impalcatura viroide con un’interazione della pianta. Viroidi replicano attraverso un meccanismo di rotolamento-cerchio in quale host vengono reclutati gli enzimi per catalizzare le diverse fasi del processo. In particolare alcuni viroidi, in particolare quelli che appartengono alla famiglia Avsunviroidae15, contengono ribozimi che sono anche coinvolti nella replica. A seconda della specie di viroide, trascrizione di viroide RNAs è mediato dall’host RNA polimerasi II o dalla RNA polimerasi cloroplastica codificate (NEP). Elaborazione di viroide RNA sembra essere catalizzata da un host RNAsi di tipo III, anche se in viroidi con RNA oligomerici ribozimi intermedi self-fendono durante la replica. Infine, i monomeri viroide risultante sono circolarizzazione, a seconda della famiglia di viroide, la ligasi del DNA ospite 1 o l’isoforma cloroplastico di tRNA ligasi16,17. Questo ultimo enzima è coinvolto nella legatura delle forme monomeriche di viroidi nella famiglia Avsunviroidae, come melanzane viroid latente (ELVd)18.
Nel corso di un lavoro per analizzare i requisiti strutturali e sequenza di ELVd che determinano il riconoscimento di melanzana (Solanum melongena L.) ligasi tRNA, abbiamo istituito un sistema sperimentale basato sulla co-espressione di entrambe le molecole dentro e. coli 19. abbiamo notato che le trascrizioni di ELVd più lungo rispetto a unità self-fendono in modo efficiente in cellule di Escherichia coli attraverso i ribozimi hammerhead incorporato e che i monomeri viroide risultante con 5′-idrossile e 2′, 3′-fosfodiestere termini erano in modo efficiente circolarizzazione dalla ligasi di tRNA melanzane co-espressi. Ancora di più, il RNA circolare viroide risultante ha raggiunto un’inattesa alta concentrazione in e. coli, superiori a quelle del endogeno rRNAs12. Assenza di replica intermedi indica la mancanza di amplificazione ELVd RNA-a-RNA in queste cellule batteriche. Interessante, inserimento di eterologa RNA in una particolare posizione della molecola viroide ha avuto un effetto moderato su accumulazione del RNAs circolare viroide-derivato12. Queste osservazioni ci ha fatto immaginare un metodo per produrre grandi quantità di ricombinante RNAs in batteri. In questo metodo, i cDNA corrispondente per il RNA di interesse vengono inseriti nel cDNA ELVd e il RNA chimerico risultante è espressa in e. coli attraverso un forte promotore costitutivo. Perché il sistema funzioni, e. coli devono essere co-trasformati con un plasmide per esprimere la melanzana ligasi di tRNA. La trascrizione di più-di-unità ELVd-derivato viene elaborata dai ribozimi hammerhead incorporato e i monomeri risultanti con termini appropriati sono riconosciuti e circolarizzazione dalla ligasi di tRNA co-espressi. In questo modo, il RNA di interesse viene inserito in un’impalcatura circolare molto stabile che consiste della molecola circolare viroide. Questo RNA chimerico recombinant molto probabilmente si è ulteriormente stabilizzata all’interno delle cellule di Escherichia coli mediante la formazione di una ribonucleoproteina complessa attraverso l’interazione con ligasi di tRNA. Utilizzando questo metodo (Vedi il protocollo qui sotto), RNA aptameri, hairpin RNA e altro RNAs strutturato è stati facilmente prodotto in quantità di decine di milligrammi per litro di coltura di Escherichia coli in condizioni di laboratorio regolari e purificato ad omogeneità prendendo vantaggio di circolarità12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre la ricerca i requisiti di struttura coinvolti nel riconoscimento della melanzana ligasi di tRNA ed ELVd sequenza, abbiamo notato che co-espressione di entrambe le molecole nel non host Escherichia coli ha condotto ad un grande accumulo imprevisto di viroide circolare forme in cellule batteriche19. Abbiamo capito che il grande accumulo di viroide RNA in e. coli era più probabilmente la conseguenza di cheesprimono una molecola di RNA altamente stabile, ad esempio il relativ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio BIO2017-83184-R e BIO2017-91865-EXP da Spagnolo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (cofinanziati fondi FEDER).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
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