Purification de cellules peu abondantes dans le système visuel de drosophile
Summary
Nous présentons ici un protocole de dissociation cellulaire pour isoler efficacement les cellules présentes en faible abondance dans le système visuel de drosophile par cellule à fluorescence activé triant (FACS).
Abstract
Des améliorations récentes dans la sensibilité du séquençage de la génération suivante ont facilité l’application de la transcriptomique et analyses génomiques à un petit nombre de cellules. Utilisant cette technologie pour étudier le développement dans le système visuel de drosophile, qui dispose d’une multitude d’outils génétiques de la cellule spécifique au type, offre une approche puissante pour aborder les bases moléculaires du développement avec résolution cellulaire précise. Une telle approche faisable, il est crucial d’avoir la capacité de façon sérieuse et efficace purifier les cellules présentes en faible abondance dans le cerveau. Nous présentons ici une méthode qui permet une purification efficace de clones de cellules du même dans les expériences de mosaïque génétique. Avec ce protocole, nous toujours atteindre un haut rendement cellulaire après que purification par fluorescence activé la cellule triant (FACS) (~ 25 % de toutes les cellules marquées) et a effectué avec succès analyse transcriptomique sur les clones de cellules unique générés par le biais analyse de mosaïque avec un marqueur de cellules répressible (MARCM). Ce protocole est idéal pour l’application de transcriptomique et analyses génomiques de types spécifiques de cellules dans le système visuel, à travers différents stades de développement et dans le contexte des différentes manipulations génétiques.
Introduction
Le système visuel de la drosophile est un modèle exceptionnel pour l’étude de la base génétique du développement et de comportement. Elle comprend une architecture cellulaire stéréotypés1 et un kit d’outils génétique avancée pour la manipulation de cellules spécifiques types2,3. Des grandes forces de ce système sont la possibilité d’interroger autonome fonction des gènes dans les cellules d’intérêt avec une résolution de cellule unique, à l’aide de méthodes de mosaïque génétique4,5. Nous avons voulu combiner ces outils génétiques avec les progrès récents dans le séquençage de génération suivant pour effectuer la transcriptomique spécifiques à un type de cellule et des analyses génomiques à cellule unique clones dans des expériences génétiques mosaïque.
Pour ce faire, il est essentiel de développer une méthode robuste et efficace pour isoler sélectivement les populations de faible cellulaire abondante dans le cerveau. Auparavant, nous avons développé un protocole pour isoler les types spécifiques de cellules dans le système visuel au cours du développement de nymphe par FACS et déterminer leurs transcriptions utilisant RNA-seq6. Dans ces expériences, la grande majorité des cellules d’un type particulier (par exemple les photorécepteurs R7) était fluorescent étiquetée. En utilisant cette méthode, dans des expériences génétiques mosaïque, où seul un sous-ensemble de cellules du même type sont étiquetés, nous n’avons pas isoler suffisamment de cellules pour obtenir les données de séquençage de qualité. Pour y remédier, nous avons cherché à augmenter le rendement cellulaire en améliorant le protocole de dissociation cellulaire.
Notre approche consistait à diminuer la longueur totale du Protocole visant à maximiser la santé des cellules dissociées, améliorer la santé cellulaire en altérant la dissection et la dissociation des tampons et réduire la quantité de rupture mécanique des tissus disséqués. Nous avons testé le protocole amélioré de7 par analyse de mosaïque avec une cellule répressible marqueur5 (MARCM), qui permet la génération du single fluorescent étiqueté clones de types de cellule en particulier, qui sont de type sauvage ou mutant pour un gène d’intérêt dans un dans le cas contraire hétérozygote volée. Lorsque, dans des conditions identiques, notre protocole antérieure n’a pas pu générer suffisamment de matière pour RNA-seq, le protocole amélioré a été réussi. Reproductible, nous atteindre un haut rendement cellulaire (~ 25 % de cellules marquées) et obtenir des données de RNA-seq haute qualité d’aussi peu que 1 000 cellules,7.
Un certain nombre de protocoles ont été décrits précédemment pour isoler les types de cellules particulières dans drosophile6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. ces protocoles sont principalement destinés à isoler les cellules qui sont abondants dans le cerveau. Notre protocole est optimisé pour isoler les populations de cellules abondantes faible (moins de 100 cellules / cerveau) dans le système visuel à l’aide de FACS pour ultérieur transcriptomique et analyses génomiques. Avec ce protocole, nous visons à fournir un moyen d’isoler reproductible des cellules abondantes faibles du système visuel mouche de FACS et d’obtenir des données de haute qualité transcriptome de RNA-Seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est simple et pas techniquement difficiles à exécuter, mais il y a plusieurs importantes mesures que si négligé volonté entraîner une réduction considérable de rendement cellulaire. (Étape 2.3.2.) Il est crucial que les croisements sont en bonne santés, et que la nourriture se dessécher. Un arrosage régulier des croisements est essentiel pour maximiser le nombre de mouches disponibles pour la dissection du génotype de la raison et au bon stade de développement. Combien de fois besoin de croisem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le NINDS de la National Institutes of Health, sous attribution numéro K01NS094545, andgrants du Centre pour l’étude des maladies neurodégénératives Lefler. Nous reconnaissons Tan chaulage et Jason McEwan pour les conversations précieuses.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
