Analys av β-Amyloid-inducerad avvikelser på Fibrin Clot struktur av spektroskopi och svepelektronmikroskopi
Summary
Presenteras här är två metoder som kan användas enskilt eller i kombination för att analysera effekten av beta-amyloid på fibrin clot struktur. Inkluderat är ett protokoll för att skapa en in vitro- fibrin clot, följt av koagel grumlighet och scanning electron microscopy metoder.
Abstract
Denna artikel presenterar metoder för att generera i vitro fibrin blodproppar och analysera effekten av beta-amyloid (Aβ) protein på koagelbildning och struktur av spektrometri och svepelektronmikroskopi (SEM). Aβ, som bildar neurotoxiska amyloid aggregat i Alzheimers sjukdom (AD), har visats interagera med fibrinogen. Denna Aβ-fibrinogen interaktion gör fibrin koagel strukturellt avvikande och resistenta mot fibrinolys. Aβ-inducerad avvikelser i fibrin koagulering kan också bidra till cerebrovaskulär aspekter av AD patologin såsom microinfarcts, inflammation, liksom, cerebral amyloid angiopati (CAA). Tanke på potentiellt kritiska rollen av neurovaskulära underskott i AD patologi, har utveckla föreningar som kan hämma eller minska Aβ-fibrinogen interaktionen lovande terapeutiskt värde. In vitro metoder genom vilka fibrin koagelbildning kan enkelt och systematiskt utvärderas är potentiellt användbara verktyg för att utveckla terapeutiska föreningar. Presenteras här är en optimerad protokoll för in vitro- generation av fibrin koagel, samt analys av effekten av Aβ och Aβ-fibrinogen interaktion hämmare. Clot grumlighet analysen är snabb, mycket reproducerbara och kan användas för att testa flera villkor samtidigt, vilket möjliggör screening av stora antal av Aβ-fibrinogen-hämmare. Hit föreningar från denna screening kan utvärderas ytterligare för sin förmåga att lindra Aβ-inducerad strukturella avvikelser av fibrin clot arkitektur med hjälp av SEM. Effektiviteten av dessa optimerade protokoll framgår här använder TDI-2760, en nyligen identifierade Aβ-fibrinogen interaktion hämmare.
Introduction
Alzheimers sjukdom (AD), en neurodegenerativ sjukdom som leder till kognitiv försämring hos äldre patienter, huvudsakligen uppkommer onormala beta-amyloid (Aβ) uttryck, aggregering och nedsatt clearance vilket resulterar i neurotoxicitet1, 2. de exakta mekanismerna bakom sjukdomen patologin trots välkarakteriserad associationen mellan Aβ-aggregat och AD3, inte är förstådda4. Ökande bevis föreslår att neurovaskulära underskott spelar en roll i progression och svårighetsgraden av AD5, som Aβ interagerar direkt med komponenter av cirkulationssystemet6. Aβ har en hög affinitet interaktion med fibrinogen7,8, som också lokaliserar till Aβ avlagringar i både AD patienter och mus modeller9,10,11. Dessutom inducerar Aβ-fibrinogen interaktionen onormal fibrin-koagelbildning och struktur, samt resistens mot fibrinolys9,12. En terapeutisk möjlighet vid behandling av AD, är att lindra cirkulatoriska underskott genom att hämma interaktionen mellan Aβ och fibrinogen13,14. Vi identifierade därför flera små föreningar att hämma den Aβ-fibrinogen interaktion med hög genomströmning screening och läkemedelskemi metoder13,14. För att testa effekten av Aβ-fibrinogen interaktion hämmare, optimerad vi två metoder för analys av in vitro- fibrin koagelbildning: koagulera grumlighet assay och scanning electron microscopy (SEM)14.
Clot grumlighet analysen är en enkel och snabb metod för att övervaka fibrin koagelbildning med hjälp av UV-synliga spektroskopi. Som fibrin koagel former, ljus är alltmer utspridda och turbiditeten av lösningen ökar. Omvänt, när Aβ är närvarande, fibrin koagel struktur ändras och turbiditeten av blandningen minskar (figur 1). Effekten av hämmande föreningar kan bedömas för potential att återställa propp turbiditet från Aβ-inducerad avvikelser. Medan grumlighet analysen möjliggör snabb analys av flera villkor, ger det begränsad information på propp form och struktur. SEM, där topografin av fasta föremål avslöjas av elektron probe, möjliggör analys av 3D arkitekturen av koagel15,16,17,18 och bedömningen av hur förekomsten av Aβ och / eller hämmande substanser förändrar det struktur9,14. Både spektrometri och SEM är klassiskt laboratorietekniker som har använts för olika ändamål, exempelvis spektrofotometri används för övervakning av amyloid aggregering19,20. Likaså används SEM också för att analysera fibrin koagel bildas av plasma från Alzheimer, Parkinson och tromboembolisk stroke patienter21,22,23. De protokoll som presenteras här är optimerade för att bedöma fibrin-koagelbildning i ett reproducerbart och snabbt sätt.
Följande protokoll finns instruktioner för beredning av ett in vitro- fibrin-clot både med och utan Aβ. Det Detaljer också metoder för att analysera effekten av Aβ fibrin koagelbildning och struktur. Effektiviteten hos dessa två metoder för att mäta hämning av Aβ-fibrinogen interaktionen demonstreras med TDI-2760, en litet hämmande förening14. Dessa metoder, möjliggör både individuellt och tillsammans, snabb och enkel analys av in vitro- fibrin koagelbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoderna som beskrivs här ger ett reproducerbara och snabba sätt att bedöma fibrin koagel bildas i vitro. Enkelheten i systemet gör dessutom tolkningen av hur Aβ påverkar fibrin koagelbildning och struktur relativt rakt fram. I denna lab’s tidigare publikation visades att dessa analyser kan användas för att testa föreningar för sin förmåga att hämma Aβ-fibrinogen interaktion13,14. Använder dessa två analyser, en serie av syntetiserade f?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso och Michael Foley från Tri-institutionella Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York för syntes av Aβ-fibrinogen interaktion hämmare och deras värdefulla förslag. Författarna vill även tacka medlemmar Strickland labbet för bra diskussion. Detta arbete fick stöd av NIH grant NS104386, Alzheimer’s Drug Discovery Foundation och Robertson terapeutiska utvecklingsfonden för H.A., NIH bevilja NS50537, den Tri-institutionella Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer’s Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation, och John A. Herrmann för S.S.
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer’s disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer’s disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer’s disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer’s disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer’s disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer’s disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer’s disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochimie. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson’s disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
