Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie
Summary
Hier zijn twee methoden die afzonderlijk of in combinatie kunnen worden gebruikt voor het analyseren van het effect van bèta-amyloid op fibrine clot structuur. Inbegrepen is een protocol voor het maken van een in vitro fibrine clot, gevolgd door clot turbiditeit en scanning elektronen microscopie methodes.
Abstract
Dit artikel bevat methoden voor het genereren van de vitro fibrine stolsels en het analyseren van het effect van bèta-amyloid (Aβ) eiwit op clot formatie en structuur door spectrometrie en scanning elektronen microscopie (SEM). Aβ, dat vormt neurotoxische amyloïde aggregaten in de ziekte van Alzheimer (AD), heeft aangetoond dat interactie met fibrinogeen. Deze interactie Aβ-fibrinogeen maakt het fibrine clot structureel abnormale en resistent zijn tegen Fibrinolyse. Aβ-geïnduceerde afwijkingen in fibrine stolling kunnen ook bijdragen aan cerebrovasculaire aspecten van de AD-pathologie zoals microinfarcts, ontsteking, evenals, Cerebrale amyloïde angiopathie (CAA). Gezien de potentieel kritische rol van neurovasculaire tekorten in AD pathologie, heeft ontwikkeling van verbindingen die kunnen remmen of verminderen van de Aβ-fibrinogeen interactie veelbelovende therapeutische waarde. In vitro methoden door welke fibrine clot vorming kan worden gemakkelijk en systematisch geëvalueerd zijn potentieel nuttige hulpmiddelen voor het ontwikkelen van therapeutische stoffen. Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerde protocol voor in vitro generatie van het fibrine clot, alsmede een analyse van het effect van Aβ en Aβ-fibrinogeen interactie-remmers. De bepaling van de troebelheid clot is snelle, zeer reproduceerbaar en kan worden gebruikt om meerdere proefomstandigheden tegelijk, waardoor voor het screenen van grote aantallen Aβ-fibrinogeen remmers. Hit verbindingen uit deze screening kunnen verder worden geëvalueerd voor hun vermogen om te verzachten Aβ-geïnduceerde structurele afwijkingen van de fibrine clot architectuur met behulp van SEM. De effectiviteit van deze geoptimaliseerde protocollen is hier aangetoond door middel van TDI-2760, een onlangs geïdentificeerde Aβ-fibrinogeen interactie inhibitor.
Introduction
De ziekte van Alzheimer (AD), een neurodegeneratieve ziekte leidt tot cognitieve achteruitgang bij oudere patienten, voornamelijk voortkomt uit abnormale amyloid-bèta (Aβ) expressie, aggregatie en verminderde klaring resulterend in neurotoxiciteit1, 2. ondanks de goed gekarakteriseerd associatie tussen Aβ aggregaten en AD3, zijn de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologie ziekte niet goed begrepen4. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat neurovasculaire tekorten een rol bij de progressie en de ernst van AD5 spelen, zoals Aβ rechtstreeks met de componenten van de bloedsomloop6 communiceert. Aβ heeft een hoge-affiniteit interactie met fibrinogeen7,8, die ook Aβ deposito’s in zowel AD patiënten en muis modellen9,10,11 lokaliseert. Bovendien is de interactie Aβ-fibrinogeen induceert abnormale fibrine-clot formatie en structuur, evenals de weerstand tegen Fibrinolyse9,12. Een van de therapeutische mogelijkheden bij de behandeling van AD, is het verlichten van bloedsomloop tekorten door remming van de interactie tussen Aβ en fibrinogeen13,14. Wij, geïdentificeerd daarom diverse kleine verbindingen remming van de Aβ-fibrinogeen interactie met behulp van hoge-doorvoer screening en medicinale chemie benaderingen13,14. Om te testen van de werkzaamheid van Aβ-fibrinogeen interactie remmers, geoptimaliseerd we twee methoden voor de analyse van in vitro fibrine clot vorming: stollen troebelheid assay en scanning elektronen microscopie (SEM),14.
Clot troebelheid assay is een rechttoe-rechtaan en snelle methode voor de controle van fibrine clot vorming met behulp van UV-zichtbaar spectroscopie. Als de fibrine clot formulieren, licht is steeds meer verspreid en de troebelheid van de oplossing verhoogt. Omgekeerd, wanneer Aβ aanwezig is, de structuur van het fibrine clot wordt gewijzigd, en de troebelheid van het mengsel wordt verminderd (Figuur 1). Het effect van remmende stoffen kan worden beoordeeld voor de mogelijkheden waaruit u wilt terugzetten clot troebelheid Aβ-geïnduceerde afwijkingen. Terwijl de troebelheid assay voor snelle analyse van meerdere voorwaarden zorgt, biedt het beperkte informatie over de klonter vorm en structuur. SEM, waarin de topografie voor massieve voorwerpen is geopenbaard door elektron sonde, zorgt voor de analyse van de 3D-architectuur van de klonter15,16,17,18 en de beoordeling van hoe de aanwezigheid van Aβ en / of inhiberende verbindingen verandert die structuur9,14. Beide spectrometrie en SEM zijn klassieke laboratoriumtechnieken die zijn gebruikt voor verschillende doeleinden, bijvoorbeeld spectrofotometrie wordt gebruikt voor de controle van amyloïde aggregatie19,20. Evenzo, SEM wordt ook gebruikt voor het analyseren van fibrine clot gevormd uit het plasma van de ziekte van Alzheimer, Parkinson en trombo-embolische beroerte patiënten21,22,23. De protocollen die hier gepresenteerd worden geoptimaliseerd voor de beoordeling van de vorming van fibrine-clot reproduceerbaar en snelle wijze.
Het volgende protocol bevat de instructies voor de voorbereiding van een in vitro fibrine-clot zowel met als zonder Aβ. Het ook een overzicht van de methoden voor het analyseren van het effect van Aβ op fibrine clot formatie en structuur. De effectiviteit van deze twee methoden voor het meten van de remming van de Aβ-fibrinogeen interactie is aangetoond door middel van TDI-2760, een kleine remmende samengestelde14. Deze methoden, toestaan zowel individueel als samen voor snelle en eenvoudige analyse van in vitro fibrine clot vorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methoden bieden een reproduceerbaar en snelle methode voor de beoordeling van fibrine clot vorming in vitro. Bovendien, de eenvoud van het systeem vergemakkelijkt de interpretatie van hoe Aβ invloed op de vorming van fibrine clot en structuur relatief rechttoe-rechtaan. In dit lab vorige publicatie, werd aangetoond dat deze tests kunnen worden gebruikt voor het testen van verbindingen voor hun vermogen om te remmen de Aβ-fibrinogeen interactie13,<sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs bedanken Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso en Michael Foley van Tri-institutionele Therapeutics Discovery Instituut (TDI), New York voor de synthese van Aβ-fibrinogeen interactie remmers en hun waardevolle suggesties. Auteurs dank ook de leden van de lab Strickland voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de NIH grant NS104386, de ziekte van Alzheimer Drug Discovery Foundation en Robertson therapeutische Ontwikkelingsfonds voor H.A., NIH verlenen NS50537, de Tri-institutionele Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation, en John A. Herrmann voor SS
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer’s disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer’s disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer’s disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer’s disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer’s disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer’s disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer’s disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochimie. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson’s disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
