En In Vitro Model af en Parallel-plade Perfusion System at studere bakteriel tilslutning til at pode væv
Summary
Vi beskriver en in-house designet i vitro flow kammer model, som giver mulighed for undersøgelse af bakteriel tilslutning til at pode væv.
Abstract
Forskellige ventil ledningsanlæg og stent monterede ventiler bruges til højre ventrikel udstrømning tarmkanalen (RVOT) ventil udskiftning hos patienter med medfødt hjertesygdom. Når du bruger proteser materialer dog, er disse grafts modtagelige for bakterielle infektioner og forskellige vært svar.
Identifikation af bakterie og vært faktorer, der spiller en afgørende rolle for endovaskulære overholdelsen af mikroorganismer er af betydning for bedre at forstå Patofysiologi af udbrud af infektioner såsom infektiøs endocarditis (IE) og at udvikle forebyggende strategier. Udviklingen af kompetente modeller at undersøge bakteriel adhæsion fysiologiske shear betingelser er derfor nødvendigt. Her, beskriver vi brugen af en nyligt udformet i vitro perfusion kammer baseret på parallelle plader der giver mulighed for undersøgelse af bakteriel tilslutning til forskellige komponenter af transplantat væv såsom fritliggende ekstracellulære matrix, endotelceller og inert områder . Denne metode kombineres med kolonidannende enhed (CFU) tælle er tilstrækkelige til at vurdere graft materialer tilbøjelighed mod bakteriel adhæsion under flow. Yderligere kan på, flow kammer system bruges til at undersøge rollen af blodkomponenter i bakteriel adhæsion shear betingelser. Vi viste, at kilden til væv, deres overflade morfologi og bakteriearter specificitet ikke er de store afgørende faktorer i bakteriel tilslutning til pode væv ved hjælp af vores in-house designet i vitro perfusion model.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) beskæftiger en række virulens strategier til at omgå immunforsvaret værtssystemet koloniserer biologiske eller ikke-biologiske overflader implanteres i det menneskelige omsætning, hvilket fører til alvorlige intravaskulær infektioner såsom sepsis og IE1,2,3,4,5. IE er fortsat et vigtigt behandling forbundet komplikation hos patienter efter implantation af kunstige hjerteklapper mens individuelle faktorer, der bidrager til udbrud af IEare ikke endnu fuldt ud forstået6,7. Under strømningsforhold støder bakterier shear styrker, som de skal overvinde for at overholde fartøj væg8. Modeller, som gør det muligt at studere samspillet mellem bakterier og proteser ventil væv eller endotel under flow, er af interesse, da de afspejler i vivo situationen mere.
Flere specifikke mekanismer lette bakteriel tilslutning i endothelial celler (ECs) og til den eksponerede subendothelial matrix (ECM) fører til væv kolonisering og modning af vegetationen, er væsentlige tidlige trin i IE9. Forskellige stafylokokker overflade proteiner eller MSCRAMMs (mikrobielle overflade komponenter anerkende klæbende matrix molekyler) er blevet beskrevet som mediatorer af adhæsion værtsceller og ECM proteiner ved at interagere med molekyler såsom fibronektin, fibrinogen, kollagen og von Willebrands faktor (VWF)8,10,11. Men i betragtning af intra molekylære foldning af nogle virulens faktorer, for det meste studerede under statiske forhold, mange af disse interaktioner kan have forskellige relevans i endovaskulære infektioner i cirkulerende blod.
Derfor præsenterer vi en in-house designet i vitro parallel-plade flow kammer model, som giver mulighed for vurdering af bakteriel tilslutning til forskellige komponenter af ECM og ECs i forbindelse med væv grafts implanteret i RVOT position. Det overordnede formål med metoden i dette arbejde er at studere mekanismer af interaktion mellem bakterier og underliggende endovaskulære væv i flow betingelser, som er tæt knyttet til blodbanen patogener i vivo miljø som S. aureus. Denne nye fremgangsmåde fokuserer på modtagelighed for graft væv overflader til bakteriel tilslutning til at identificere potentielle risikofaktorer for udvikling af IE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nylige kliniske observationer give særlig opmærksomhed til IE som en komplikation hos patienter har undergået ventil udskiftning af RVOT6,13. Dysfunktion af den implanterede ventil i IE er resultatet af bakteriel interaktion med for Intravaskulært transplantat fører til omfattende inflammatoriske og prokoagulant reaktioner1,14. Modellen præsenteres nye in vitro- tilladt os at undersøge hvi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse var sponsoreret af et tilskud af forskning fond KU Leuven (OT/14/097) givet til RH. TRV var postdoc stipendiat af CVE Research Foundation – Flandern (Belgien; Giver nummer – 12K0916N) og RH understøttes af klinisk forskning fond UZ Leuven.
Materials
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | – | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF – ultrapure water – H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides – Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel – surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves–assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
