Gen Expression analyse i Endothelial celler udsat for Shear Stress ved hjælp af flere Parallel-plade Flow kamre
Summary
Her præsenteres en arbejdsproces for kultur og gen expression analysen i endothelial celler under væske shear stress. Inkluderet er en fysisk arrangement for samtidig boliger og overvågning flere flow kamre i et kontrolleret miljø og brugen af en udefrakommende reference RNA til kvantitativ PCR.
Abstract
Vi beskriver en arbejdsgang til analyse af genekspression fra endotelceller underlagt en stabil laminar flow ved hjælp af flere overvågede parallel-plade flow kamre. Endotelceller danne indre cellulære foring af blodkar og kronisk er udsat for den friktion kraft af blodgennemstrømningen kaldet shear stress. Under fysiologiske tilstande, endotelceller funktion i forskellige shear stress betingelser. Anvendelse af shear stress betingelser i in vitro- modeller giver således, kan større indsigt i endothelial svar in vivo. Parallel-plade flow salen tidligere udgivet af Lane et al. 9 er tilpasset til at studere endotel RIBOREGULATION i tilstedeværelse og fravær af stabil (ikke-pulsatile) laminar flow. Centrale tilpasninger i set-up for laminar flow som præsenteres her omfatter en stor, dedikeret miljø til hus samtidige flow kredsløb, overvågning af strømningshastigheder i realtid, og medtagelsen af en udefrakommende henvisning RNA for en normalisering af kvantitative real-time PCR data. For at vurdere flere behandlinger/betingelser med anvendelse af shear stress, bruges flere flow kredsløb og pumper samtidig inden for den samme opvarmet og befugtet inkubator. Strømningshastigheden af hver flow kredsløb måles kontinuerligt i realtid at standardisere shear stress betingelser i hele eksperimenterne. Fordi disse eksperimenter har flere betingelser, bruge vi også en eksogen reference RNA, der er tilsat i på tidspunktet for RNA udvinding til normalisering af RNA udvinding og første-streng cDNA syntese effektivitetsgevinster. Disse trin minimerer variabiliteten mellem prøver. Denne strategi er beskæftiget i vores pipeline for gen expression analyse med shear stress eksperimenter ved hjælp af parallel-plade flow kammer, men dele af denne strategi, som de eksogene reference RNA spike-in, kan nemt og omkostningseffektivt bruges til andre programmer.
Introduction
Vaskulære endotel celler danner den indvendige cellulære foring af blodkar i det lukkede kardiovaskulære system af større arter. De udgør grænsefladen mellem blod og væv og er karakteriseret ved luminale og abluminal overflader. Endotelet er et mangfoldigt, aktive og adaptive system, der regulerer blodgennemstrømning, næringsstof handel, immunitet, og væksten af nyt blod fartøjer1. I kroppen findes endotelceller normalt i et miljø, hvor de er udsat for omsætning, shear stress2friktion kraft. Shear stress er en vigtig regulator i endothelial celle gen expression3, og endotelceller forsøger at opretholde shear stress inden for et givet område2,4. Endotelceller demonstrere angiogene mønster i mangel af shear stress5 , der kan forbedre væv perfusion. Regionale mønstre forstyrret strømmen og ændrede shear stress er tilknyttet udtryk for inflammatoriske gener6 og udviklingen af åreforkalkning7,8. Således er modeller, der omfatter shear stress en vigtig del i forståelsen af endotel genregulering.
Vi beskriver en metode til at studere genregulering i vaskulære endotel celler under shear stress. Dette system bruger ikke-pulsatile flow og efterligner væske shear stress niveauer og koncentration af ilt at model betingelser for arteriel endotelceller. Denne protokol indeholder oplysninger om metoder til gen knockdown ved hjælp af RNA-interferens (RNAi), set-up for anvendelsen af shear stress ved hjælp af parallel-plade flow apparater og metoder til spike-in af en udefrakommende reference RNA inden analyse af reverse transkriptase kvantitative polymerase kædereaktion (RT-qPCR). Denne rørledning er brugt til at studere RIBOREGULATION i endothelial celler i tilstedeværelse og fravær af laminar shear stress og omfatter en tilpasning af parallel-plade flow apparatet beskrevet af Lane et al. 9. denne særlige set-up var designet til at lette den samtidige vurdering af flere forsøgsbetingelser, der giver mulighed for direkte sammenligning af shear stress tilstande, samt normalisering af RNA analyse. En stor opvarmet enhed med kontrolleret fugtighed er udnyttet til at tillade flere separate flow kamre og pumper skal køre samtidig med strømningshastigheder overvåges for hver flow kammer forsamling i realtid. Anvendelsen af dette set-up bruges til gen knockdown ved hjælp af RNAi i fastsættelsen af laminar flow/shear stress, men aspekter af denne protokol kan anvendes på enhver vurdering af RNA udtryk.
Fælles tilgange til anvendelsen af shear stress i endothelial celler omfatter mikrofluid systemer10, en kegle og plade viskosimeter11og en parallel-plade flow afdeling12. Mikrofluid systemer fra forskellige producenter har været nyttige i at studere mechanobiology og mechanotransduction i flere celler og vævstyper og en bred vifte af biofysiske stimuli. I endothelial celler, har de været brugt til at studere endotelceller i isolation, samt interaktion i endothelial celler og handel med immun eller tumor celler10. Men disse systemer er mindre egnet til genopretning af et stort antal celler9. Både kegle og plade viskosimeter og parallel-plade flow kamre tillader inddrivelse af stort antal celler i Konfluerende monolag12. Disse systemer kan generere en række shear styrker og mønstre12. Parallel-plade flow kammer forsamling9 har fordelen at real-time imaging kan udføres gennem glasrude at evaluere cellulære morfologi på ethvert tidspunkt. Derudover kan perfusate indsamles under sterile forhold. For det system, der præsenteres her, kan strømmen også overvåges i realtid og i en multi kammer set-up, som letter vedligeholdelsen af shear forhold mellem afdelingerne.
Repræsentative eksperimenter, menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVEC), som repræsenterer en makrovaskulære endotel celletype, der anvendes, og shear stress betingelser vi bruger (1 Pa) afspejler arteriel betingelser (0,1 – 0,7 Pa). Men denne protokol kan bruges med andre endotel celletyper, og shear stress betingelser kan reguleres efter de eksperimentelle spørgsmål. For eksempel, vurderingen af menneskelige endotelceller i betingelser, som model venøs cirkulation ville kræve lavere niveauer af shear stress (1-6 Pa) og undersøgelser, at model mikrovaskulære omsætning har udnyttet shear stress niveauer af 0,4 – 1,2 Pa13 , 14. Derudover shear stress kan variere selv mellem endotelceller inden for den samme blodkar6. I den nuværende struktur, en enkelt overvågningssystem anvendes der kan samtidig overvåge fire separate flow sløjfer. For laboratorier, der har brug for mere flow sløjfer, er der plads i den dedikerede miljø for en yderligere overvågningssystem.
RT-qPCR bruges til den absolutte kvantitering af genekspression i indstillingen af shear stress. Den relative udtryk for target gener er ofte bruges til at sammenligne RNA udtryk på tværs af betingelser. Nogle RNA arter kan findes i meget små mængder eller være fraværende og således komplicere relative målinger. For eksempel, kan længe noncoding RNA’er i endothelial celler udøve potent virkninger på relativt lav copy numre pr. celle5. Desuden kan forskelle i primer effektivitet føre til en unøjagtig fortolkning fra udnytte delta-delta cycle tærskel (Ct) metode til at analysere dataene. For at imødegå denne bekymring, udføre vi absolutte kvantitering ved at generere en standardkurve ved hjælp af en kendt mængde af plasmid DNA. Desuden supplerer DNA (cDNA) syntese er en ineffektiv proces, og forskelle i cDNA effektivitet kan redegøre for forskelle i RNA udtryk mellem betingelser og prøver15. Anvendelsen af shear stress og/eller Transfektion reagenser kan påvirke celleproliferation, apoptose og levedygtighed eller tilføje komponenter, der kan forstyrre RNA isolering og/eller cDNA syntese. For at tage hensyn til muligheden for bias fra RNA isolering og cDNA syntese, bruger vi en spike-RNA objektet syntetiseret i laboratoriet, tilføjet på tidspunktet for RNA udvinding og målt med hver cDNA syntese via RT-qPCR. Dette giver ikke kun en justering for tekniske forskelle i RNA udvinding og cDNA syntese, men også tillader beregning af absolutte mængder pr. celle, når celletal er kendt.
Dette system bruger yderligere skridt til at opretholde lighed eller redegøre for tekniske forskelle mellem betingelser. Vi understrege især disse trin på grund af den komplekse karakter af disse eksperimenter, der involverer flere fysiske set-ups og forsøgsbetingelser, som kan føre til eksperimentel variation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Shear stress er en fysiologisk tilstand, der modulerer endotelfunktion, dels ved at påvirke steady-state gen expression2,5. Modeller af RIBOREGULATION i forskellige shear stress betingelser vil bidrage til en større forståelse af endotelfunktion. Denne pragmatiske arbejdsproces indeholder et flow kredsløb ved hjælp af en parallel-plade flow kammer tilpasset fra Lane et al. 9 og repræsenterer laminar, ikke-pulsatile flow. Den…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af CIHR MOP 142307 til P.A.M. H.S.J.M. er en modtager af en canadisk institutter af sundhed forskning træningsprogram i regenerativ medicin Fellowship. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. og M.K.D. er modtagere af dronning Elizabeth II ph.d. stipendier inden for videnskab og teknologi.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
