Gen uttryck analys av Endothelial celler utsätts för Shear Stress med hjälp av flera parallella-plattan flöde Chambers
Summary
Här presenteras ett arbetsflöde för kultur och gen uttryck analys av endotelceller under vätska skjuvspänningen. Ingår en fysiska arrangemang för samtidigt bostäder och övervaka flera flöde chambers i en kontrollerad miljö och användning av en exogen referens RNA för kvantitativ PCR.
Abstract
Vi beskriva ett arbetsflöde för analys av genuttryck från endotelceller omfattas av en stadig laminärt flöde använder flera övervakade parallell-plattan flöde chambers. Endothelial celler bildar cellulära innerfoder av blodkärl och kroniskt är utsatta för friktion kraft blodflödet kallas skjuvspänning. Under fysiologiska betingelser, endotelceller funktion i närvaro av olika skjuvspänning. Tillämpningen av skjuvspänning i in vitro- modeller kan således ge större insikt i endotel Svaren i vivo. Parallell-plattan flöde kammaren tidigare utgiven av Lane et al. 9 är anpassad att studera endothelial genreglering i närvaro och frånvaro av stadig (icke-pulserande) laminärt flöde. Viktiga anpassningar i upplägget för laminär som presenteras här inkluderar en stor, dedikerad miljö att huset samtidiga flöde kretsar, övervakning av flöden i realtid, och införandet av en exogen referens RNA för normalisering av kvantitativ realtids PCR-data. För att bedöma flera behandlingar/villkor med tillämpning av skjuvspänning, används flera flöde kretsar och pumpar samtidigt inom samma uppvärmd och befuktade inkubatorn. Flödet av varje flöde krets mäts kontinuerligt i realtid för att standardisera skjuvspänning i hela experimenten. Eftersom dessa experiment har flera villkor, använder vi också en exogen referens-RNA som är spetsade-i vid tidpunkten för RNA-extraktion för normalisering av RNA-extraktion och första-strand cDNA syntes effektivitetsvinster. Dessa steg minimera variabiliteten mellan prover. Denna strategi är anställd i vår pipeline för gen uttryck analys med skjuvspänningen experiment med parallell-plattan flöde kammaren, men delar av denna strategi, såsom den exogena referera RNA spike-i, kan enkelt och kostnadseffektivt sätt användas för andra program.
Introduction
Vascular endothelial celler bildar cellulära innerfoder av blodkärlen i det slutna kardiovaskulära systemet av högre arter. De utgör gränssnittet mellan blod och vävnader och kännetecknas av luminala och abluminal ytor. Endotelet är en mångsidig, aktiva och adaptiva system som reglerar blodflödet, näringsämne människohandel, immunitet och tillväxten av nytt blod fartyg1. I kroppen finns endotelceller normalt i en miljö där de utsätts för cirkulation, skjuvspänningen2friktion kraft. Skjuvspänning är en viktig regulator av endotelceller gene expression3och endotelceller försöker upprätthålla skjuvspänningen inom ett givet intervall2,4. Endotelceller demonstrera angiogena mönstring i avsaknad av skjuvspänningen5 som kan förbättra vävnadsperfusion. Regionala mönster av störd flöde och förändrad skjuvspänning är associerade med uttrycket av inflammatoriska gener6 och utvecklingen av åderförkalkning7,8. Modeller som inkluderar skjuvspänning är således en viktig komponent för att förstå endothelial genreglering.
Vi beskriver en metod för att studera genreglering i vaskulära endotelceller under skjuvspänning. Detta system använder icke-pulserande flöde och härmar vätska skjuvspänningen nivåer och syrgaskoncentrationsmonitor det modell villkoren för arteriell endotelceller. Detta protokoll innehåller uppgifter om metoder för den gen knockdown använder RNA-interferens (RNAi), set-up för tillämpningen av shear stress med parallell-plattan flöde apparater och metoder för spike-av en exogen referens RNA före analys av omvänd-transkriptas kvantitativa polymeras-kedjereaktion (RT-qPCR). Denna rörledning används för att studera genreglering i endotelceller i närvaro och frånvaro av laminar skjuvspänning och omfattar en anpassning av parallell-plattan flow apparaten beskrivs av Lane et al. 9. detta särskilt upplägg var utformad för att underlätta samtidiga bedömningen av flera experimentella villkor som tillåter direkt jämförelse av skjuvspänning, samt normalisering av RNA analys. En stor uppvärmd enhet med kontrollerad luftfuktighet används för att tillåta flera separata flöde chambers och pumpar vara igång samtidigt med flöden som övervakas för varje flöde kammare sammansättning i realtid. Tillämpningen av detta upplägg används för genen knockdown med hjälp av RNAi i fastställandet av laminär/skjuvspänning, men aspekter av detta protokoll kan tillämpas på någon bedömning av RNA uttryck.
Gemensamt förhållningssätt till tillämpningen av shear stress för endotelceller inkluderar mikroflödessystem system10, en Kotte-och-tallrik viskometer11och en parallell-plattan flöde kammaren12. Mikroflödessystem system från olika tillverkare har varit användbar i att studera Mekanobiologi och mechanotransduction i flera cell- och vävnadstyper- och olika biofysiska stimuli. För endotelceller, har de använts för att studera endotelceller i isolering, samt samspelet mellan endotelceller och handel med immun eller tumör celler10. Dessa system är dock mindre lämpligt för återvinning av ett stort antal celler9. Både kon-och-tallrik viskometer och parallell-plattan flöde chambers tillåter återvinning av stort antal celler i konfluenta enskiktslager12. Dessa system kan generera en rad skeva styrkor och mönster12. Parallell-plattan flöde kammare montering9 har fördelen att realtid imaging kan utföras genom glasfönstret att utvärdera cellulära morfologi vid någon tidpunkt. Dessutom kan perfusatet samlas under sterila förhållanden. För systemet presenteras här, kan flödet också övervakas i realtid och en multi chamber set-up, vilket underlättar underhåll av skeva villkor mellan kamrarna.
För representativa experiment, mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC), som företräder en makrovaskulära endotelceller typ, används och skjuvspänning vi använder (1 Pa) återspeglar arteriell villkor (0,1 – 0,7 Pa). Emellertid detta protokoll kan användas med andra typer av endothelial celler och skjuvspänning kan justeras enligt den experimentella frågan. Till exempel utvärdering av mänskliga endothelial celler i förhållanden som modell venösa cirkulationen skulle kräva lägre nivåer av skjuvspänning (1-6 Pa) och studier som modell mikrovaskulära omlopp har utnyttjat skjuvspänningen nivåer av 0,4 – 1,2 Pa13 , 14. Dessutom skjuvspänningen kan variera även mellan endotelceller inom samma blodkärl6. I den nuvarande strukturen, ett enda övervakningssystem används som kan samtidigt övervaka fyra separata flöde loopar. För labs som behöver mer flöde loopar, finns det utrymme i den dedikerade miljön för ett system för övervakning av ytterligare.
RT-qPCR används för absoluta kvantitering av genuttryck i inställningen av shear stress. Relativa uttrycket av målgener används ofta att jämföra RNA uttryck över villkoren. Vissa RNA arter kan finns på mycket små mängder eller vara frånvarande, vilket komplicerar relativa mätningar. Exempelvis kan långa icke-kodande RNAs i endotelceller utöva potenta effekter vid relativt låga kopia nummer per cell5. Dessutom kan skillnader i primer effektivitet leda till en felaktig tolkning från utnyttja metoden delta-delta cycle tröskel (Ct) att analysera data. För att lösa detta problem, utför vi absolut kvantifiering genom att generera en standardkurva med en känd mängd av plasmid DNA. Dessutom kompletterande DNA (cDNA) syntes är en ineffektiv process, och skillnader i cDNA effektivitet kan redogöra för skillnader i RNA uttryck mellan villkor och prover15. Tillämpningen av shear stress eller transfection reagenser kan påverka cellproliferation, apoptos och livskraft eller lägga till komponenter som kan interferera med RNA isolering eller cDNA syntes. För att beakta möjligheten att bias från RNA isolering och cDNA syntes, använder vi en spike-i RNA kontroll syntetiseras i labbet, lagt till vid tidpunkten för RNA-extraktion och mätt med varje cDNA syntes via RT-qPCR. Detta tillåter inte bara justeringen för tekniska skillnader i RNA-extraktion och cDNA syntes men låter också beräkning av absolut kvantiteter per cell, när celltalet är känd.
Detta system använder ytterligare steg att behålla likheten eller hänsyn till tekniska skillnader mellan villkoren. Vi betonar särskilt dessa steg på grund av den komplicerade karaktären av dessa experiment, som inbegriper flera fysiska uppställningar och experimentella förhållanden som kan leda till experimentella variabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skjuvspänning är ett fysiologiskt tillstånd som modulerar endotelfunktion, delvis genom att påverka steady state gen uttryck2,5. Modeller av genreglering i olika skjuvspänning kommer att bidra till en större förståelse för endotelfunktion. Denna pragmatiska arbetsflödet innehåller en flöde krets använder en parallell-plattan flöde kammare anpassad från Lane et al. 9 och representerar laminär, icke-pulserande flöde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av CIHR MOP 142307 till pam. H.S.J.M. är mottagare av en kanadensisk institut av forskning utbildning hälsoprogram i regenerativ medicin gemenskap. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. och M.K.D. är mottagare av drottning Elizabeth II Graduate stipendierna i vetenskap och teknik.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
