यहाँ हम चूहों के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के मौखिक प्रशासन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान, मल के नमूनों का संग्रह, डीएनए निष्कर्षण और qPCR द्वारा मल बैक्टीरिया की ठहराव.
आंत microbiota मानव स्वास्थ्य पर एक केंद्रीय प्रभाव पड़ता है । माइक्रोबियल dysbiosis ऐसे भड़काऊ आंत्र रोग, अस्थमा और गठिया के रूप में कई आम immunopathologies के साथ जुड़ा हुआ है । इस प्रकार, microbiota अंतर्निहित तंत्र को समझना-प्रतिरक्षा प्रणाली crosstalk महत्वपूर्ण महत्व का है । एंटीबायोटिक प्रशासन, जबकि रोगज़नक़ निकासी सहायता, भी आकार और आंतों बैक्टीरियल समुदायों जो मानव स्वास्थ्य पर एक प्रभाव हो सकता है की संरचना में भारी परिवर्तन लाती है । चूहों में एंटीबायोटिक उपचार recapitulates प्रभाव और एंटीबायोटिक इलाज रोगियों से मानव microbiota में दीर्घकालिक परिवर्तन, और माइक्रोबियल समुदायों और प्रतिरक्षा कोशिका समारोह में परिवर्तन के बीच यंत्रवत लिंक की जांच सक्षम बनाता है । जबकि चूहों के एंटीबायोटिक उपचार के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है, उनमें से कुछ गंभीर निर्जलीकरण और वजन घटाने डेटा की व्याख्या उलझी पैदा । यहां, हम मौखिक एंटीबायोटिक प्रशासन जो बड़े वजन-नुकसान उत्प्रेरण के बिना चूहों के दीर्घकालिक उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए दो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इन प्रोटोकॉल एंटीबायोटिक दवाओं है कि दोनों ग्राम सकारात्मक और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया को लक्षित का एक संयोजन का उपयोग करें और पीने के पानी में या मौखिक gavage द्वारा या तो विज्ञापन libitum प्रदान किया जा सकता है । इसके अलावा, हम qPCR जो एंटीबायोटिक उपचार की प्रभावकारिता को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता द्वारा मल नमूनों में माइक्रोबियल घनत्व के ठहराव के लिए एक विधि का वर्णन । इन तरीकों के संयोजन आंत्र microbiota के हेरफेर और चूहों में एंटीबायोटिक उपचार के प्रभाव के अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय पद्धति प्रदान करता है ।
स्तनधारी जठरांत्र म्यूकोसा एक अद्वितीय सूक्ष्मजीवों कि मेजबान के साथ एक mutualistic संबंध स्थापित करने का एक अत्यधिक जटिल मिश्रण द्वारा बृहदांत्र वातावरण है । आंत्र म्यूकोसा की रक्षा प्रणाली एक उपकला परत और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ढेर सारे है कि आंत के भीतर commensals सीमित करते हुए उनकी संख्या और विविधता के संरक्षण शामिल हैं । इसके विपरीत, खाना खानेवाला जीवों को एक पूरी तरह कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के लिए आवश्यक हैं । जबकि मेजबान और खाना खानेवाला बैक्टीरिया के बीच बातचीत आम तौर पर फायदेमंद होते हैं, यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि dysregulated प्रतिरक्षा प्रणाली-microbiota crosstalk पुराने भड़काऊ रोगों के विकास के पक्ष में कर सकते हैं, ऐसे asinflammatory आंत्र रोग, गठिया या अस्थमा1,2.
आंत microbiota विभिंन कारकों से बदला जा सकता है, लेकिन शायद सबसे भारी परिवर्तन एंटीबायोटिक उपचार है कि गंभीर रूप से दोनों आकार और बैक्टीरियल समुदायों3,4की संरचना बदल द्वारा प्रेरित कर रहे हैं । जबकि संक्रमण के इलाज के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के लाभों को संदिग्ध हैं, microbiota मनुष्यों में एंटीबायोटिक जोखिम द्वारा प्रेरित परिवर्तन भी प्रतिरक्षा सुरक्षा जो स्वास्थ्य पर हानिकारक प्रभाव के लिए नेतृत्व कर सकते है संशोधित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, मनुष्यों में एंटीबायोटिक उपचार क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल-प्रेरित दस्त, अस्थमा और3कैंसर के कुछ प्रकार के एक बढ़ा जोखिम से जोड़ा गया है । चूहों में एंटीबायोटिक उपचार recapitulates प्रभाव और एंटीबायोटिक इलाज रोगियों के पेट समुदायों में पाया दीर्घकालिक परिवर्तन, और माइक्रोबियल समुदायों और प्रतिरक्षा सेल समारोह में परिवर्तन के बीच यंत्रवत लिंक की जांच सक्षम है । हालांकि, कई रिपोर्टों से पता चला है कि पीने के पानी पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन libitum परिणाम बहुत ध्यान से चूहों के रूप में पीने के पानी से बचना, संभवतः अपनी बेईमानी स्वाद5,6के कारण । इस प्रकार, इन मॉडलों में गंभीर निर्जलीकरण मौखिक एंटीबायोटिक प्रशासन के लिए सहवर्ती प्रतिरक्षा कोशिका समारोह में एंटीबायोटिक उपचार के प्रभाव की पहचान करने के लिए लक्ष्य प्रयोगों की व्याख्या जटिल हो सकता है ।
कई दृष्टिकोण आंतों के डिब्बे में माइक्रोबियल समुदायों के आकार और संरचना का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है7. अगली पीढ़ी sequencing प्रौद्योगिकियों इस मामले8पर अमूल्य डेटा प्रदान की है, लेकिन इन तरीकों अपेक्षाकृत महंगे है और डेटा की व्याख्या के लिए विशेषज्ञ bioinformatic विश्लेषण की आवश्यकता होती है । दूसरी ओर, पारंपरिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी संस्कृति के तरीकों जीवाणु प्रजातियों का पता लगाने की अनुमति है, लेकिन वे कम संवेदनशीलता है और खाना खानेवाला बैक्टीरिया का एक बड़ा अंश (विशेष रूप से anaerobes) बहुत मुश्किल या असंभव के साथ खेती करने के लिए कर रहे हैं वर्तमान में उपलब्ध विधियाँ8. मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) तकनीक ठहराव और मल जीवाणु प्रजातियों की पहचान के लिए तेजी से इस्तेमाल किया जा रहा है, के रूप में वे कुल माइक्रोबियल लोड के एक तेज और विश्वसनीय संस्कृति स्वतंत्र उपाय प्रदान करते हैं । तदनुसार, qPCR तरीके उम्र के साथ जुड़े microbiota में परिवर्तन या भड़काऊ आंत्र रोग9,10सहित कई रोगों की प्रगति के साथ अध्ययन करने के लिए उपयोगी साबित कर दिया है । इस के साथ लाइन में, qPCR तरीके एक तेजी से और लागत प्रभावी करने के लिए विभिन्न उपचार (एंटीबायोटिक्स सहित) मल बैक्टीरियल भार में और microbiota संरचना10,11,12के प्रभाव को मान्य करने के लिए दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।
यहां, हम चूहों, मल नमूना संग्रह, डीएनए निष्कर्षण, मानकों की तैयारी और qPCR द्वारा मल नमूनों में बैक्टीरिया के ठहराव के लिए दो अलग प्रोटोकॉल के एक विस्तृत कदम दर कदम खाते में उपस्थित । इन प्रोटोकॉल चूहों में आंत्र microbiota में हेरफेर करने के लिए और आंत्र homeostasis और रोग में एंटीबायोटिक उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करते हैं ।
यहां हम चूहों और qPCR द्वारा मल बैक्टीरिया की ठहराव के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के मौखिक प्रशासन के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवाओं के संयोजन (युक्त एम्पीसिलीन, gentamicin, निओमायसिन, metronidazole और vancomycin) दोनों ग्राम सकारात्मक और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, बैक्टीरिया की एक पूरी स्पेक्ट्रम के खिलाफ जीवाणुनाशक गतिविधि की पेशकश लक्ष्य । पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं के दोनों मौखिक gavage और प्रशासन बहुत मल बैक्टीरियल लोड5,6,12कमी । इसके अलावा, दोनों उपचार चूहों के phenotype पर एक गहरा प्रभाव के रूप में वे कम तिल्ली आकार और बढ़े हुए अंधान्त्र सहित रोगाणु मुक्त चूहों की विशिष्ट कई विशेषताओं का विकास है । एंटीबायोटिक प्रशासन के लिए एक विशेष विधि का चयन संभवतः मौखिक gavage विधि के रूप में प्रयोग की लंबाई पर निर्भर कर सकते है एंटीबायोटिक दवाओं के दैनिक प्रशासन की आवश्यकता है, और अधिक श्रम गहन जा रहा है और संभवतः के लिए और अधिक असुविधा के कारण लंबी दौड़ में पशु ।
पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन के लिए, सावधानी एंटीबायोटिक मिश्रण करने के लिए स्वीटनर के अलावा के साथ लिया जाना चाहिए के रूप में इस निर्जलीकरण से चूहों रखने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । कई समूहों से पता चला है कि कैसे पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन (स्वीटनर के अलावा बिना) बहुत गंभीर और तेजी से वजन-सभी चूहों के साथ कम करने की ओर जाता है प्रारंभिक शरीर के वजन के 20% से अधिक प्रयोग5 के पहले कुछ दिनों के भीतर खोने , 6. हमारे प्रोटोकॉल में, सैक्रीन आधारित मिठास का उपयोग करने के लिए पर्याप्त पानी में एंटीबायोटिक स्वाद मुखौटा और चूहों एंटीबायोटिक प्रशासन के बाद पहले कुछ दिनों में वजन कम लग रहा था, लेकिन उनके वजन के बाद जल्दी से बरामद ( चित्रा 1) । बहरहाल, हमारे प्रयोगों में 5-10% चूहों की अभी भी मानव अंत बिंदु तक पहुँचने > 20% आधारभूत शरीर के वजन के नुकसान और euthanized होने की जरूरत. हम भी sucralose आधारित स्वीटनर्स का परीक्षण किया है जो पूरी तरह से चूहों निर्जलीकरण को रोकने में विफल रहा है (१००% के चूहों खो > 20% वजन का) जबकि अन्य लेखकों aspartame आधारित मिठास5,6के लिए समान विफलताओं प्रकाशित किया है. इस के लिए जोड़ा गया, उंर, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया चूहों की सामांय स्वास्थ्य स्थिति पर विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि वे एंटीबायोटिक उपचार के दौरान वजन घटाने और पशुओं की भलाई को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रकार, चूहों वजन और सामांय स्वास्थ्य स्थिति की सावधान निगरानी मौखिक एंटीबायोटिक प्रशासन के पहले दो हफ्तों के दौरान दैनिक प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
qPCR तरीकों मल नमूनों में 16S rRNA के ठहराव के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । हालांकि, कुछ सीमाओं सहित इस तकनीक के बारे में विचार किया जाना चाहिए: i) एक विश्वसनीय उच्च गुणवत्ता मानक के लिए आवश्यकता; ii) डिजाइन और qPCR प्राइमरों की दक्षता; iii) तथ्य यह है कि सूक्ष्मजीवों 16S rRNA जीन के विभिंन प्रतिलिपि संख्या हो सकती है, इस प्रकार जीन प्रतियां सीधे बराबर नहीं सेल गणना15हो सकता है । बहरहाल, qPCR एक मजबूत और संवेदनशील विधि है जो मल के नमूनों के तेजी से विश्लेषण में सक्षम बनाता है । इस विधि के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जल्दी से (एंटीबायोटिक दवाओं सहित) विभिंन उपचार के प्रभाव के रूप में यहां विस्तृत मल बैक्टीरियल भार में मांय । इसके अलावा, हालांकि हम कुल 16S rRNA के ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, इस विधि को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है (विशिष्ट प्राइमर16डिजाइन करके) व्यक्तिगत बैक्टीरियल taxa की पहचान को सक्षम करने के लिए, इस प्रकार दोनों मात्रात्मक और प्रदान microbiome आकार और संरचना के बारे में गुणात्मक जानकारी ।
संक्षेप में, हम चूहों के मौखिक एंटीबायोटिक उपचार के लिए दो प्रोटोकॉल प्रदान की है और एक qPCR आधारित विधि मल बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रेरित परिवर्तन यों तो । हालांकि इन प्रोटोकॉल और अनुकूलित किया जा सकता है और व्यक्तिगत प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार अंय दृष्टिकोण के साथ संयुक्त, वे जल्दी के रूप में सेवा कर सकते हैं, लागत प्रभावी और विश्वसनीय उपकरण murine आंत्र microbiota में हेरफेर करने के लिए और प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आंत्र homeostasis और रोग में एंटीबायोटिक उपचार के ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए ब्रिटेन के चिकित्सा अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया (पीईबी श्री के लिए अनुदान/L008157/ R.J. एक मैरी क्यूरी इंट्रा यूरोपीय फैलोशिप (H2020-MSCA-IF-2015-703639) द्वारा समर्थित किया गया था; P.M.B. ब्रिटेन चिकित्सा अनुसंधान परिषद और किंग कॉलेज लंदन डॉक्टरेट प्रशिक्षण जैव चिकित्सा विज्ञान में भागीदारी से एक छात्र द्वारा समर्थित किया गया था (श्री/N013700/
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (Merck) | A9518 | |
Neomycnin trisulfate salt hydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | N1876 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich (Merck) | M3761 | |
Vancomycin hydrochloride | Sigma-Aldrich (Merck) | V2002 | |
Gentamicin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Merck) | G3632 | |
Tryptone | Sigma-Aldrich (Merck) | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich (Merck) | Y1625 | |
NaCL | Sigma-Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sweetener Sweet'n Low | Sweet'N Low | Available in the UK from Amazon.co.uk | |
X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside) | Fisher scientific | 10234923 | |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | |
Ultrapure Agarose | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 16500500 | |
RT-PCR grade water | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM9935 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725124 | with ROX |
TOPO TA cloningTM for sequencing | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 450030 | |
QIAamp fast DNA Stool mini kit | Qiagen | 51604 | |
QIAprep spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Syringe filter 0.45µm | Fisher scientific | 10460031 | |
Swann-MortonTM Carbon steel sterile scalpel blades | Fisher scientific | 11792724 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | 300613 | |
1.5ml Crystal clear microcentriguge tube | StarLab | E1415-1500 | |
2ml Ultra high recovery microcentrifuge tube | StarLab | I1420-2600 | |
Oral dosing needles 20Gx38 mm curved (pk/3) | Vet-Tech | DE008A | |
Sterilin petri dish 50 mm | Scientific Laboratory Supplies | PET2020 | |
Absolute qPCR plate seals | Thermo Fisher Scientific | AB1170 | |
MicroAmpTM optical 384-well plate | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4309849 | |
ViiA7TM 7 real-time PCR system with 384-well block | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4453536 | |
Spectrophotometer (Nanodrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | |
Labnet Prism microcentrifuge | Labnet | C2500 | |
MultiGene Optimax Thermal cycler | Labnet | TC9610 |