Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för oral administrering av antibiotika till möss, samling av fekal prover, DNA-extraktion och kvantifiering av fekal bakterier av qPCR.
Tarmfloran har en central inverkan på människors hälsa. Mikrobiell dysbios är förknippad med många vanliga immunopathologies såsom inflammatorisk tarmsjukdom, astma och artrit. Thus, förstå mekanismerna bakom bakterieflora-immunsystemet överhörning är av avgörande betydelse. Antibiotikumet administrering, medan medhjälp patogen clearance, inducerar också drastiska förändringar i storlek och sammansättning av intestinal bakteriella samhällen som kan ha en inverkan på människors hälsa. Antibiotikabehandling hos möss recapitulates inverkan och långsiktiga förändringar i människans bakterieflora från antibiotiska behandlade patienter och gör utredningen av de mekanistiska samband mellan förändringar i mikrobiella samhällen och immunceller funktion. Medan flera metoder för antibiotikabehandling av möss har beskrivits, framkalla några av dem allvarlig uttorkning och viktminskning komplicerar tolkningen av data. Här, ger vi två protokoll för oral antibiotika administrering som kan användas för långtidsbehandling av möss utan förmå större viktminskning. Dessa protokoll utnyttja en kombination av antibiotika som mål både grampositiva och gramnegativa bakterier och kan tillhandahållas antingen ad libitum i dricksvattnet eller via oral sondmatning. Dessutom beskriver vi en metod för kvantifiering av mikrobiell densitet i fecal prov av qPCR som kan användas för att validera effekten av antibiotika behandling. Kombinationen av dessa synsätt ger en tillförlitlig metod för manipulering av den intestinala bakterieflora och studien av effekterna av antibiotikabehandling hos möss.
Däggdjur gastrointestinala slemhinnan är en unik miljö som koloniserats av en mycket komplex blandning av mikroorganismer som skapar en mutualistisk relation till värden. Försvaret av tarmslemhinnan består av en epiteliala lagret och en uppsjö av immunceller som begränsar förknippas inom tarmen samtidigt som deras antal och mångfald. Omvänt, kommensaler organismer krävs för utvecklingen av en fullt fungerande immunförsvar. Interaktioner mellan värd och kommensaler bakterier är normalt fördelaktigt, blir det allt tydligare att dysreglerad immunförsvaret-bakterieflora överhörning kan gynna utvecklingen av kroniska inflammatoriska sjukdomar, sådana asinflammatory tarm sjukdom, artrit eller astma1,2.
Tarmfloran kan ändras av olika faktorer, men kanske de mest drastiska förändringarna induceras av antibiotikabehandling som kraftigt förändrar både storlek och sammansättning av bakteriesamhällen3,4. Fördelarna med antibiotika för att behandla infektioner är obestridliga, kan bakterieflora förändringar orsakade av antibiotika exponering hos människa också ändra immunförsvar vilket kan leda till skadliga effekter på hälsa. Exempelvis behandling med antibiotika hos människa har kopplats till en ökad risk för Clostridium difficile-diarré, astma och vissa typer av cancer3. Antibiotikabehandling hos möss recapitulates inverkan och långsiktiga förändringar i tarmen samhällen av antibiotikum-behandlade patienter och har aktiverat utredning av de mekanistiska samband mellan förändringar i mikrobiella samhällen och immunceller funktion. Flera rapporter har dock visat att administrering av antibiotika på den dricksvatten ad libitum resulterar i mycket märkbar viktminskning som möss avstå från att dricka vatten, förmodligen på grund av dess foul smak5,6. Således i dessa modeller kan den svår dehydrering samtidig oral antibiotika administration komplicera tolkningen av experiment som syftar till att identifiera effekten av antibiotikabehandling i immunceller funktion.
Flera metoder kan användas för att utforska storlek och sammansättning av mikrobiella samhällen i intestinal fack7. Nästa generations sekvensering teknik har tillhandahållit ovärderlig information om denna fråga8, men dessa metoder är relativt dyra och kräver expert bioinformatiska analyser för tolkningen av data. Däremot, traditionella mikrobiologiska kultur metoder möjliggöra upptäckt av bakteriearter, men de har låg känslighet och en stor del av kommensaler bakterier (särskilt anaerober) är mycket svårt eller omöjligt att odla med för närvarande tillgängliga metoder8. Kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) tekniker används alltmer för kvantifiering och identifiering av fekal bakteriearter, eftersom de ger en snabb och tillförlitlig kultur-oberoende mått på total mikrobiell belastning. QPCR metoder har således visat sig vara användbart för att studera förändringar i den bakterieflora som är associerad med ålder eller progression av flera sjukdomar inklusive inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom9,10. I linje med detta ger qPCR metoder en snabb och kostnadseffektiv metod för att validera effekten av olika behandlingar (inklusive antibiotika) fekal bakterier laster och bakterieflora sammansättning10,11,12.
Här presenterar vi en detaljerad steg för steg-redovisning av två distinkta protokoll för oral antibiotika administrering till möss, fekal provtagning, DNA-extraktion, beredning av standarder och kvantifiering av bakterier i fecal prov av qPCR. Dessa protokoll ger en tillförlitlig metod att manipulera den intestinala bakterieflora hos möss och studera effekterna av antibiotikabehandling vid intestinala homeostas och sjukdom.
Här tillhandahåller vi experimentella protokoll för oral administrering av antibiotika till möss och kvantifiering av fekal bakterier av qPCR. Kombinationen av antibiotika används i detta protokoll (innehållande ampicillin, gentamicin, neomycin, metronidazol och vankomycin) mål både grampositiva och gramnegativa bakterier, erbjuder bakteriedödande aktivitet mot ett fullt spektrum av bakterier. Både oral sondmatning och administrering av antibiotika i dricksvattnet kraftigt minska fekal bakteriell belastning5,6,12. Dessutom har båda behandlingarna en djupgående effekt på fenotypen av möss när de utvecklar flera egenskaper som är typiska för bakteriefria möss inklusive minskad mjältstorlek och utvidgade blindtarmen. Valet av en särskild metod för antibiotikumet administrering kan möjligen bero på längden av experimentet som oral sondmatning metoden kräver daglig administrering av antibiotika, att vara mer arbetsintensiva och eventuellt orsakar mer obehag för de djur på lång sikt.
För administrering av antibiotika i dricksvattnet, måste försiktighet iakttas med tillägg av sötningsmedlet till antibiotika blandningen eftersom detta är en avgörande faktor att hålla möss från uttorkning. Flera grupper har visat hur administrering av antibiotika i dricksvatten (utan tillsats av sötningsmedel) leder till mycket allvarliga och snabb viktminskning med alla möss att förlora mer än 20% av ursprungliga kroppsvikt inom de första dagarna av experiment5 , 6. i våra protokoll, användning av sötningsmedlet sackarin-baserade tycktes vara tillräcklig för att maskera den antibiotiska smaken i vattnet och möss gick ner i vikt de första dagarna efter administrering av antibiotika, men återhämtade sig deras vikter snabbt efter att ( Figur 1). Dock i våra experiment 5-10% av mössen fortfarande nå humana slutpunkten av > 20% förlust av baslinjen kroppsvikt och behövde till vara euthanized. Vi har också testat sukralos-baserade sötningsmedel som helt misslyckats med att förhindra möss uttorkning (100% av möss som förlorat > 20% av vikten) medan andra författare har publicerat liknande misslyckanden för aspartam-baserade sötningsmedel5,6. Till detta övervägas ålder, genetisk bakgrund och allmänna hälsotillståndet hos de möss som används för experiment, eftersom de kan påverka viktminskning och djurens välbefinnande under behandling med antibiotika. Noggrann övervakning av möss vikt och allmänna hälsotillstånd bör således utföras dagligen under de första två veckorna av oral antibiotika administrering.
qPCR metoder ger en snabb och kostnadseffektiv metod för kvantifiering av 16S rRNA i fekal prover. Dock vissa begränsningar bör beaktas när det gäller denna teknik inklusive: jag) kravet på en tillförlitlig hög standard. (II) design och effektivitet av qPCR primers; (III) det faktum att mikroorganismer kan ha olika exemplar nummer av 16S rRNA-genen, således gen kopior kan inte direkt lika cell räknas15. Ändå, qPCR är en robust och känslig metod som möjliggör snabb analys av fekalt prover. Denna metod kan vara särskilt användbart för att snabbt validera effekten av olika behandlingar (inklusive antibiotika) i fekal bakterier laster som detaljerad här. Dessutom, även om vi tillhandahåller ett protokoll för kvantifiering av totala 16S rRNA, denna metod kan lätt anpassas (genom att utforma specifika primers16) till möjliggöra identifiering av enskilda bakteriell taxa, vilket ger både kvantitativa och kvalitativ information om mikrobiomet storlek och sammansättning.
Sammanfattningsvis har vi tillhandahållit två protokoll för oral antibiotikabehandling av möss och en qPCR-baserad metod för att kvantifiera antibiotikum-inducerade förändringar i fekal bakterier. Även om dessa protokoll kan ytterligare optimerad och kombineras med andra metoder utifrån individuella experimentella behov, kan de fungera som snabbt, kostnadseffektivt och tillförlitligt verktyg för att manipulera det murina tarmens bakterieflora och studera effekter av antibiotikabehandling vid intestinala homeostas och sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av brittiska Medicinska forskningsrådet (grant till P.B. Herr/L008157/1); R.J. stöddes av en Marie Curie Intra-European Fellowship (H2020-behöriga myndigheters-IF-2015-703639); P.M.B. stöddes av en STUDENTTILLVARO från UK Medicinska forskningsrådet och King’s College London forskarnivå utbildning partnerskap i biomedicinsk vetenskap (herr/N013700/1).
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (Merck) | A9518 | |
Neomycnin trisulfate salt hydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | N1876 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich (Merck) | M3761 | |
Vancomycin hydrochloride | Sigma-Aldrich (Merck) | V2002 | |
Gentamicin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Merck) | G3632 | |
Tryptone | Sigma-Aldrich (Merck) | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich (Merck) | Y1625 | |
NaCL | Sigma-Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sweetener Sweet'n Low | Sweet'N Low | Available in the UK from Amazon.co.uk | |
X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside) | Fisher scientific | 10234923 | |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | |
Ultrapure Agarose | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 16500500 | |
RT-PCR grade water | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM9935 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725124 | with ROX |
TOPO TA cloningTM for sequencing | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 450030 | |
QIAamp fast DNA Stool mini kit | Qiagen | 51604 | |
QIAprep spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Syringe filter 0.45µm | Fisher scientific | 10460031 | |
Swann-MortonTM Carbon steel sterile scalpel blades | Fisher scientific | 11792724 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | 300613 | |
1.5ml Crystal clear microcentriguge tube | StarLab | E1415-1500 | |
2ml Ultra high recovery microcentrifuge tube | StarLab | I1420-2600 | |
Oral dosing needles 20Gx38 mm curved (pk/3) | Vet-Tech | DE008A | |
Sterilin petri dish 50 mm | Scientific Laboratory Supplies | PET2020 | |
Absolute qPCR plate seals | Thermo Fisher Scientific | AB1170 | |
MicroAmpTM optical 384-well plate | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4309849 | |
ViiA7TM 7 real-time PCR system with 384-well block | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4453536 | |
Spectrophotometer (Nanodrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | |
Labnet Prism microcentrifuge | Labnet | C2500 | |
MultiGene Optimax Thermal cycler | Labnet | TC9610 |