نقدم بروتوكولا لكشف البروتينات غير مسمى واحد البصرية في الوقت الحقيقي كما أنها هي ويفرز من الخلايا الحية. يستند هذا الفحص المجهري التداخل السوناريه نثر (إيسكات)، التي يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية المختلفة والتكوينات.
علينا أن نظهر مجهرية التداخل السوناريه نثر (إيست)، طريقة قادرة على اكتشاف البروتينات غير مسمى واحد يفرز من الخلايا الحية الفردية في الوقت الحقيقي. في هذا البروتوكول، ونحن تغطية الخطوات الأساسية لتحقيق مجهر إيسكات وتكمل ذلك مع القنوات تصوير إضافية لمراقبة صلاحية خلية قيد الدراسة. وفي أعقاب ذلك، نستخدم الأسلوب للكشف في الوقت الحقيقي من البروتينات وحيدة كما أنها هي تفرز من خلية حية التي نظهر مع خط ب-خلية مخلدة (Laz388). وتناقش الخطوات اللازمة فيما يتعلق بإعداد المجهر وعينه وكذلك تحليل البيانات المسجلة. البروتوكول فيديو يوضح هذا الفحص المجهري إيسكات يوفر طريقة مباشرة لدراسة إفراز على مستوى جزيء واحد.
يفرز البروتينات تلعب دوراً هاما في العمليات الفسيولوجية المختلفة1. وبسبب هذا، يتم درسوا بشكل روتيني فرقة جماعي (البروتينات) أو ككيانات فردية2،3. البروتيوميات تقليديا تحقق مجموعة كاملة من البروتينات موجودة في نظام بيولوجي معين عن طريق مثلاً، فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) أو قياس التدفق الكتلي4،5، 6. البروتينات وحيدة، ومن ناحية أخرى، يتم عموما الكشف عن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تستند إلى الأسفار7،8أو9،plasmonics10إلكترون المبردة11 ميكروسكوبيس. كل من هذه التقنيات استخدام الأدوات المعقدة، ووضع العلامات، أو كليهما، وغالباً ما تفتقر إلى معلومات حيوية كما أنها تقدم فقط معلومات طويلة الأجل حول النظام قيد الدراسة.
هنا نستخدم إيست12،13 الفحص المجهري للاحساس بالبروتينات الافرازية الفردية مع الأزمنة الفرعية الثانية14. الأهم من ذلك، يكشف الأسلوب الإشارات متناثرة ضعيفة الأصيلة لكل12،البروتين14. جداول كمية الضوء التي تنتشر بيوبارتيكلي صغيرة مع ما الاستقطابية. وعلى افتراض أنه يمكن تقريب شكل البروتين نثر فعالة مجال14،،من1516، وأن مختلف البروتينات الانكسار مشابهة جداً، ويمكن أن تكون الإشارة المقاسة مباشرة متصل بالوزن الجزيئي (ميغاواط) من البروتين. معايرة التباين إيست مقابل الوزن الجزيئي بالقياسات المرجعية التجريبية يسمح أحد للتمييز بين البروتينات ذات أحجام مختلفة. تجارب إيسكات سهولة يمكن أن تستكمل بالأسفار مجهرية17،18، والكواشف الممتز، فضلا عن تسميات الفلورسنت أو بعثرة للسماح للكشف عن أي البروتين الفائدة14 محددة , 17 , 19.
من حيث المبدأ، وظائف إيست بتضخيم الضوء متناثرة ضعيفة للبروتين عن طريق التداخل السوناريه الاختلاط مع موجه مرجع ثانوي. كثافة المكتشفة () في إيسكات يصفها المجهر
حيث شدة الحادث،
معامل لمساهمة موجه الإشارة،
يدل على قوة ونثر النانو-الكائن قيد الدراسة، و
هي مرحلة التحول بين متناثرة ومرجع أمواج،14. أما المنقولة أو تنعكس مرة أخرى الحادث الضوء يستخدم عادة كموجة إشارة، حيث في كل حالة
حسابات ترانسميسيفيتي أو انعكاسية الدائرة عينة، على التوالي. المصطلح
يتناسب مع البروتين تناثر عبر الباب ويمكن إهمال مقارنة بمصطلح الصليب. وهكذا، وضع
للتدخل المدمر كاملة، وضوء الكشف عن ترد عليه
حيث
شدة الإشارة و
شدة التدخل.
إيسكات المجهري يوفر وسيلة ممتازة لدراسة العمليات البيولوجية على مستوى جزيء واحد. على سبيل مثال، نحن التحقيق في الخلايا Laz388 – فيروس ابشتاين-بار (EBV) تحول اللمفاويات بالخليه خط20،21 – كما أنها تفرز البروتينات مثل الأجسام المضادة IgG16. ومع ذلك، الأسلوب العام ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية الأخرى. إيست هو أصلاً غير محدد ويمكن الكشف عن أي بروتين أو نانوحبيبات أو أنه يمكن تمديدها مع أساليب الروغان السطح المشترك لكشف محددة أو متعدد. بساطته والقدرة على الجمع بين التقنيات البصرية الأخرى، مثل الفحص المجهري الأسفار، جعل إيست أداة تكميلية قيمة في خلية علم الأحياء.
أحد الجوانب الأكثر أهمية للحصول على بيانات مفيدة إيسكات هو القدرة على العثور على الموضع التنسيق الصحيح في السطح ساترة، وعلاوة على ذلك، لشغل هذا المنصب لفترات طويلة من الزمن. عدم القيام بذلك سيؤدي إلى توسيع بسفس وإشارات ضعيفة إيست والقطع الأثرية المرتبطة بالانجراف في تحليل ديناميات. كما تبين أن إيجاد المستوى البؤري في ساترة نظيفة، والعارية السطح ليس مهمة سهلة كما السمات السطحية غير مرئية على خلفية شعاع مرجع كبير (انظر الشكل 4 د).
صور إيست الخام هي غالباً ما تحجب الإشارات الخلفية التي تنشأ من الشوائب واجهة الموجه في مصدر الإثارة، ويمكن أن تعوق قدرة المرء على العثور على الطائرة التصوير الصحيح. الطرح واجهة الموجه النشط طريقة مفيدة للتحايل على هذه المشكلة ورصد تركيز إيست في وقت لاحق أثناء قياس16. إحدى الطرق لتحقيق ذلك من خلال تعديل العينة المكانية. وباختصار، ينطبق مولد دالة موجه مربعة 50 هرتز إلى منفذ التحكم الخارجي المرحلة بيزو، مما أدى تعديل عينة مكانية في تواتر التطبيقية (290 نانومتر السعة) إلى. يتم تشغيل الكاميرا متزامن المقتنيات من نفس المصدر، وعند الجمع بينها ومن خلال التقيد بالمبادئ، النتيجة في14،صورة واجهة الموجه تعويض16. عادة ما يظهر الصورة الناتجة خشونة السطح من ساترة (4e الشكل). ميزات الصغيرة المتبقية على الزجاج بعد التنظيف يمكن استخدامها لإحضار المجهر إلى التركيز. قد يتم تغيير المعلمات المستخدمة لهذه الخطوة الطرح الخلفية نشط وفقا لمعدل الإطار، زمن التعرض، أو الأجهزة.
كما سبقت الإشارة إلى ذلك، ينصح باستخدام مقسم شعاع عالية الجودة في الإعداد إيست (الخطوة 1.2.1.)، كالتصوير المصنوعات اليدوية مثل الظلال أو التدخل الناجمة عن شق شعاع مستو رفيع سوف تؤثر على الصورة وتخل القياس. يبين الشكل 7 مقارنة بين الخائن شعاع عالية الجودة ومنخفضة الجودة. إظهار كل الصور إيست الخام في نفس المنطقة على ساترة التي تحتوي على بعض الجزيئات المتبقية. تم استخدام نفس الإعداد إيست لالتقاط الصور على حد سواء، جرى تبادل فقط شعاع التقسيم. يظهر الشكل 7a الصورة تشكلت في الكاميرا باستخدام أكثر سمكا (5 ملم)، الفاصل الحزم المغلفة AR، ومثبتة. نظراً لتصميم ويدجيد، الشعاع المنعكس من السطح الخلفي للتقسيم شعاع مواز المضادة لانعكاس الناشئة عن السطح الأمامي ولم يدخل الهدف. يحدث لا تدخل المصنوعات اليدوية. 7b الرقم يظهر نفس الحقل للعرض على العينة ولكن هذه المرة استخدمت أرق الخائن شعاع مستو (1 مم). تأملات اثنين من السطوح الأمامية والخلفية للتقسيم شعاع مواز وتنتشر إلى الكاميرا. المصنوعات اليدوية التدخل تكون مرئية بوضوح.
رقم 7: المقارنة بين الصور إيست المنتجة مع شق شعاع عالية ومنخفضة الجودة- (أ) الصورة إيست الخام الناتجة عن طريق استخدام المقسم شعاع سميكة ع المغلفة ومثبتة 5 ملم. (ب) صورة إيست الخام الناتجة من نفس المنطقة باستخدام مقسم شعاع مستو سميكة 1 مم. وقد شق شعاع كلا بنفس نسبة تقسيم (انعكاس 50%، نقل 50%). ولوحظت تدخل التحف الفنية الناشئة عن تأملات فريسنل وضوح في الصورة المنتجة مع التقسيم شعاع مستو سميكة 1 مم. تغيير حجم أشرطة: 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
في هذا البروتوكول يصف لنا مخطط إضاءة واسع المجال إيست كما أنها سريعة وسهلة لتحقيق ويسمح للاستشعار موازية على مساحة كبيرة14. نهج مشترك آخر هو استخدام انحراف البصرية أكوستو (أودس) ومسح شعاع [كنفوكل] عبر ال12،عينة17. هذا النهج يتجنب الحاجة إلى وافيفرونتس عالية الجودة ولكن تجريبيا أكثر تعقيداً من تصوير واسع المجال التقليدي. وعلاوة على ذلك، يحد من أودس سرعة إنارة [كنفوكل]. استناداً إلى المعلمات التجريبية المطلوبة، يمكن، من حيث المبدأ، تستخدم أنظمة الإضاءة [كنفوكل] أو واسع المجال أما للكشف عن البروتينات وحيدة ويفرز من الخلايا الحية.
كما ورد في البروتوكول، من الضروري التقليل من تقلبات الميكانيكية الأفقي في المرحلة من المجهر. يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في إطارات الكاميرا على التوالي حتى نانومتر الانحرافات في موقف العينة والحث على الضوضاء الدخيلة الهامة في الصورة التفاضلية. ولذلك يوصي باستخدام مرحلة مجهر مستقرة ميكانيكيا وثُبِّط جدول ضوئية (الخطوة 1.1.1.) وتغطية الإعداد مع الستائر الضوئية أو لوحات خلال تجربة (الخطوة 3.5.).
يمكن أيضا النظر في مخطط تركيز نشط لتحقيق استقرار للقياسات الطويلة الأجل. في هذا النهج، تدمج المجهر في ترتيب مجموع التأمل داخلي (TIR) ليزر ثانية، وتصويرها في وقت لاحق على الضوئي رباعي. ترجمة التغييرات في التركيز للنظام إلى تشريد الأفقي لليزر تير بقعة على صمام رباعي، التي يمكن استخدامها في حلقة التغذية مرتدة نشط للتحكم في محور ع المرحلة بيزو26. وهكذا يتم القضاء على آثار الانحراف الرأسي طويلة الأجل.
يمكن تطبيق العديد من التعديلات وملحقات لهذه التقنية المقدمة لتلبية احتياجات محددة تجريبية. على سبيل المثال، تتوفر حاضنات المرحلة مجهر التجارية سهولة يمكن أن تدمج في المجهر إيسكات للتصوير الطويلة الأجل للخلايا. يمكن أيضا تنفيذ تقنيات أخرى لتكملة التصوير إيست، مثل [كنفوكل] أو النقل البري الدولي الفلورية ميكروسكوبيس17. للتكيف على النظام قيد الدراسة، إفراز إيست قياسات يمكن الاضطلاع في الوسائط المحمولة الأخرى مثل دميم أو دببس، ومع ذلك، أحمر الفينول مؤشر الرقم الهيدروجيني ينبغي تجنب كما أنها يمكن أن تخل بهذه التجربة بسبب امتصاص ضوء الليزر. بالإضافة إلى ذلك، ملاحق مثل مصل العجل الجنين (FCS) أو الصفائح الدموية البشرية ليستي (hPL) تحتوي على البروتينات التي قد تتداخل مع الكشف عن إيست. اعتماداً على حساسية المرجوة من هذه التجربة، ينبغي أن تستبعد هذه المكملات من المتوسطة مجهرية.
إيسكات يعتمد على قدرة أكثر للضوء المبعثر – خاصية جوهرية لجميع البروتينات – وهو بالتالي غير محدد أصلاً. ومع ذلك، بعض درجة التحديد الممكن كمقياس إشارات إيست خطيا مع البروتين الشامل14،،من2728. وهذا يسمح لمعايرة نظام إيست باستخدام عينات البروتين القياسية، مثل ألبومين المصل البقري (BSA) والفيبرينوجين14،،من2728. وفي الواقع، ومؤخرا جداً، الشباب et al. 28 قد مدد في أعمال بيلياريك & ساندوغدار14 وأظهرت أن إيست يمكن استخدامها لتحديد الوزن الجزيئي للبروتينات صغيرة مثل ستريبتافيدين (53 كاتشين) بقرار جماعي من 19 كاتشين ودقة كاتشين حوالي 5. يمكن أن تكمل النهج التقليدية عدة أخرى إيست بتوفير مستوى إضافي من خصوصية. كمثال، فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA)، و/أو غيرها من التعديلات السطحية، تقييد البروتين ربط أحداث بحيث فقط البروتين المستهدف هو الكشف عن16.
في هذا البروتوكول، وصفت لنا كيف يمكن استخدام الفحص المجهري إيست للتحقيق في الإفرازات الخلوية على مستوى البروتين وحيد مع الأزمنة سوبسيكوند16. التقنية عامة ويمكن تنفيذها على أي مجهر التجارية أو الصنع. على عكس النهج fluorescence جزيء واحد، الأسلوب لا تعاني من فوتوبليتشينج أو وامض الآثار ولكن لا يزال يحقق حساسية البروتين وحيد. هذه الميزات تجعل إيست أداة قوية في مجال بيوسينسينج والفحص المجهري. التطبيقات المستقبلية ستركز على توضيح التفاعلات الخلوية المعقدة مثل استجابة مناعية للتحفيز أو الاتصالات الخلوية.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل تدعمها جمعية ماكس بلانك وألكسندر-فون-هامبولت الأستاذية الأوقيانوغرافية ألماني (CRC 1181). ونحن نشكر شافر ستيفاني في ارلنجن Universitätsklinikum لتوفير خلايا Laz388 والمناقشات المفيدة. ونشكر إيهلوف سيمون وشواب مكسيم في مكتبة لتقديم الدعم التقني.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |