我们提出了一种实时光学检测单个未标记蛋白质的协议, 因为它们是从活细胞分泌的。这是基于干涉散射 (iscat) 显微镜, 可应用于各种不同的生物系统和配置。
我们展示了干涉散射 (iscat) 显微镜, 这是一种能够实时检测单个活细胞分泌的单个未标记蛋白质的方法。在该协议中, 我们涵盖了实现 iscat 显微镜的基本步骤, 并以额外的成像通道对其进行补充, 以监测正在研究的细胞的生存能力。接下来, 我们使用的方法, 实时检测单个蛋白质, 因为他们是从一个活细胞分泌, 我们演示与不朽的 b 细胞系 (laz388)。讨论了显微镜和样品制备以及记录数据分析的必要步骤。视频协议表明, iscat 显微镜为研究单分子水平的分泌物提供了一种简单的方法。
分泌的蛋白质在各种生理过程中起着重要作用1。正因为如此, 它们通常作为一个集体组合 (蛋白质组学) 或作为单个实体2,3进行研究。蛋白质组学传统上通过酶联免疫吸附法 ( elisa )、流式细胞仪或质谱4,5、 6。另一方面, 单一蛋白质通常使用基于荧光7、8、等离子体 9、10或低温电子11 的各种技术来检测显微镜。所有这些技术都使用复杂的仪器、标签或两者兼而有之, 并且通常缺乏动态信息, 因为它们只提供有关所研究系统的长期信息。
在这里, 我们使用 iscat12,13显微镜来检测单个分泌蛋白与亚秒时间分辨率 14。重要的是, 该技术检测每个蛋白质12,14所固有的微弱分散信号。小生物的光的数量随其极化性而扩展。假设蛋白质的形状可以用一个有效的散射球体14,15,16近似, 并且不同的蛋白质具有非常相似的折射率, 测量的信号可以直接连接到蛋白质的分子量 (mw)。通过参考测量对 iscat 对比度与分子量进行经验校准, 可以区分不同大小的蛋白质。iscat 实验可以很容易地得到荧光显微镜17、18、免疫吸附试剂以及荧光或散射标签的补充, 以便对任何感兴趣的蛋白质进行特定检测14,17,19岁
原则上, iscat 的功能是通过与二次参考波的干涉混合来放大蛋白质的弱散射光。在 iscat 显微镜中检测到的强度 () 由
入射强度在哪里,
是参考波贡献的系数,
表示所研究的纳米物体的散射强度,
是散射与参量之间的相移波14。传输的入射光或反向反射的入射光通常用作参考波, 在每一种情况下
分别考虑样品室的透射率或反射率。这个术语
与蛋白质的散射截面成正比, 与交叉项相比可以忽略。因此,
在设置完全破坏性干扰时, 检测到的光是
由
参考强度和
干扰强度给出的。
iscat 显微镜为研究单分子水平的生物过程提供了一种很好的方法。例如, 我们研究了 laz388 细胞–epstein-barr 病毒 (ebv) 转化为 b 淋巴细胞系 20,21 –因为它们分泌蛋白质, 如 igg 抗体16。然而, 这种方法是通用的, 可以应用于各种其他生物系统。iscat 本质上是不具体的, 可以检测任何蛋白质或纳米颗粒, 或者它可以扩展与一般的表面功能化方法, 用于特定或多路复用检测。它的简单性和与荧光显微镜等其他光学技术相结合的能力, 使 iscat 成为细胞生物学中一个有价值的补充工具。
获得有用的 iscat 数据的最关键的一个方面是能够在覆盖层表面找到正确的焦点位置, 此外, 还能够长时间保持这一位置。如果做不到这一点, 就会导致 psf 扩大, iscat 信号变弱, 动态分析中与漂移相关的伪影。事实证明, 在干净、裸露的盖板表面上找到焦面并不是一件容易的事情, 因为在大参考光束背景下看不到表面特征 (见图 4d)。
原始的 iscat 图像通常被激发源中的波前杂质产生的背景信号所掩盖, 并可能阻碍一个人找到正确成像平面的能力。主动波前减法是一种有用的方法来规避此问题, 并随后在测量16期间监视 iscat 焦点。实现此目的的一种方法是通过空间采样调制。简而言之, 函数发生器将 50 hz 方波应用于压电级的外部控制端口, 从而在应用频率 (290 nm 振幅) 处进行空间采样调制。同步摄像机采集是从同一来源触发的, 如果通过锁定原理组合, 会产生波前补偿图像14,16。生成的图像通常显示盖板的表面粗糙度 (图 4e)。清洁后玻璃上剩余的小特征可用于使显微镜聚焦。此活动背景减法步骤所使用的参数可以根据帧速率、曝光时间或硬件进行更改。
如上所述, 建议在 iscat 设置 (步骤 1.2.1) 中使用高质量的光束拆分器, 因为成像的人工制品, 如由薄薄的平面光束拆分器产生的鬼影或干扰, 会影响图像并干扰测量。图 7显示了高质量和低质量分束器之间的比较。这两个原始的 iscat 图像都显示了包含一些残余颗粒的覆盖物上的相同区域。使用相同的 iscat 设置来捕获这两个图像, 只交换了分束器。图 7a显示了使用较厚 (5 毫米)、ar 涂层和楔形分束器在相机上形成的图像。由于楔形设计, 分束器后表面的反射光束与前表面产生的反射是反平行的, 没有进入目标。不发生干扰文物。图 7b显示了样品上的相同视场, 但这次使用了较薄的平面分束器。从分束器的前表面和后表面反射的两个反射是平行的, 并传播到相机。干涉文物是显而易见的。
图 7: 使用高质量和低质量分束器生成的 iscat 图像的比较.(a)使用5毫米厚、ar 涂层和楔形分束器生成的原始 iscat 图像。(b)使用1毫米厚的平面分束器生成同一区域的原始 iscat 图像。两个分束器具有相同的分裂比 (50% 反射, 50% 传输)。在1毫米厚的平面分束器产生的图像中, 可以清楚地观察到菲涅耳反射产生的干扰文物。刻度条: 2μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
在该协议中, 我们描述了 iscat 的广域照明方案, 因为它快速、易于实现, 并允许在大面积14 上进行并行检测。另一种常见的方法是使用声光偏转器 (aod) 并扫描样品 12、17的共聚焦光束。这种方法避免了对高质量波前的需求, 但比传统的广域成像在实验上更为复杂。此外, 共聚焦照明的速度受到 aod 照明速度的限制。根据所需的实验参数, 原则上可以利用共聚焦或广域照明方案来检测活细胞分泌的单一蛋白质。
正如整个协议所讨论的, 必须最大限度地减少显微镜样品阶段的横向机械波动。即使是样品位置上的纳米偏差也会导致连续相机帧的变化, 并在差分图像中产生明显的外部噪声。因此, 建议在实验期间使用机械稳定的显微镜级和阻尼光学工作台 (步骤 1.1.1), 并在实验期间用光学窗帘或面板覆盖设置 (步骤 3.5)。
还可以考虑为长期测量制定积极的重点稳定计划。在这种方法中, 第二个激光被整合到显微镜中的一个总内部反射 (tir) 安排, 然后成像到一个象限光电二极管。系统焦距的变化转化为象限二极管上 tir 激光光斑的侧向位移, 然后可在有源反馈回路中使用该位移来控制压电第26阶段的 z 轴.因此, 消除了长期的垂直漂移效应。
可以对所提出的技术进行一些修改和扩展, 以满足特定的实验需要。例如, 商业显微镜阶段孵化器可随时集成到 iscat 显微镜中, 用于细胞的长期成像。其他技术也可以实现, 以补充 iscat 成像, 如共聚焦或 tir 荧光显微镜17。为了适应所研究的系统, isccat 的分泌量可以在其他细胞介质 (如 dmem 或 dpbs) 中进行, 但由于激光吸收会干扰实验, 因此应避免 ph 指示剂苯酚红色。此外, 补充剂, 如胎儿小牛血清 (fcs) 或人血小板裂解液 (hpl) 含有蛋白质, 可能会干扰 iscat 检测。根据实验所需的灵敏度, 这些补充剂应排除在显微镜介质之外。
iscat 依赖于分析物散射光的能力–这是所有蛋白质所固有的特性–因此本质上是非特异性的。然而, 一定程度的特异性是可能的, 因为 iscat 信号与蛋白质质量14,27,28呈线性扩展。这样就可以使用标准的蛋白质样本校准 iscat 系统, 如牛血清白蛋白 (bsa) 和纤维蛋白原14、27、28。事实上, 最近, young等人.28个扩展了 piliarik & amp; sandoghdar14的工作, 并表明 iscat 可用于确定小的条纹四维蛋白 (53 kda) 的蛋白质分子量, 质量分辨率为 19 kda, 精度约为 5 kda。几种传统方法可以通过提供额外的特异性来进一步补充 iscat。例如, 酶联免疫吸附试验 (elisa) 和其他表面修饰限制了蛋白质结合事件, 因此只检测到目标蛋白 16.
在这个协议中, 我们描述了如何使用 iscat 显微镜来研究细胞分泌物在单个蛋白质水平与亚秒时间分辨率16。该技术是通用的, 可以在任何商业或自制显微镜上实施。与单分子荧光方法相比, 该方法不受光漂白或闪烁效应的影响, 但仍能实现单蛋白敏感性。这些特性使 iscat 成为生物传感和显微镜领域的有力工具。未来的应用将侧重于阐明复杂的细胞相互作用, 如对刺激或细胞通信的免疫反应。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了马克斯·普朗克协会、亚历克桑德-冯-洪堡教授和德国论坛 (crcs1181) 的支持。我们感谢 erlangen 大学的 stefanie schaffer 提供 laz388 细胞并进行了有益的讨论。我们感谢 mpl 的 simone ihloff 和 maksim schwab 提供的技术支持。
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |