Nous présentons un protocole pour la détection optique en temps réel des protéines sans étiquette simples car elles sont sécrétées par les cellules vivantes. Celle-ci repose sur la microscopie interférométrique diffusion (iSCAT), qui peut être appliquée à une variété de configurations et différents systèmes biologiques.
Nous démontrons microscope interférométrique diffusion (iSCAT), une méthode permettant de détecter des protéines sans étiquette unique sécrétées par les cellules de vie individuel en temps réel. Dans ce protocole, nous couvrons les étapes fondamentales pour réaliser un microscope iSCAT et le compléter avec des chaînes supplémentaires d’imagerie pour surveiller la viabilité d’une cellule à l’étude. Suite à cela, nous utilisons la méthode de détection en temps réel des protéines simples car elles sont sécrétées par une cellule vivante qui nous démontrent avec une lignée de B-cellules immortalisée (Laz388). Les auteurs discutent des mesures nécessaires concernant la préparation du microscope et l’échantillon ainsi que l’analyse des données enregistrées. Le protocole vidéo montre que la microscopie iSCAT offre une méthode simple pour étudier la sécrétion à l’échelle de la molécule unique.
Protéines sécrétées jouent un rôle important dans divers processus physiologiques1. Pour cette raison, ils sont systématiquement étudiés comme un ensemble collectif (protéomique) ou comme des entités individuelles2,3. Protéomique étudie traditionnellement l’ensemble des protéines présentes dans un système biologique particulier par p. ex., les dosages immuno-enzymatique (ELISA), cytométrie de flux ou spectrométrie de masse4,5, 6. Protéines simples, en revanche, sont détectés en général en utilisant une variété de techniques qui reposent sur la fluorescence7,8, plasmonique9,10ou électrons cryogéniques11 microscopies. Toutes ces techniques utilisent des instruments complexes, étiquetage ou les deux et manquent souvent d’informations dynamique car ils offrent uniquement des informations à long terme sur le système à l’étude.
Ici, nous utilisons iSCAT12,13 microscopie à protéines sécrétoires individuelles de sens avec la seconde résolution temporelle14. Ce qui est important, la technique détecte le signal épars faiblesse intrinsèque à chaque protéine12,14. La quantité de lumière qui disperse un bioparticle petite échelles avec sa polarisabilité. En supposant que la forme d’une protéine peut être approchée par une dispersion efficace sphère14,15,16et que différente protéines ont des indices de réfraction très similaires, le signal mesuré peut être directement connecté à la masse moléculaire (mm) de la protéine. L’étalonnage empirique d’iSCAT contraste par rapport à la masse moléculaire de mesures de référence permet de distinguer les protéines de différentes tailles. iSCAT expériences peuvent facilement être complétés par microscopie de fluorescence17,18, immuno réactifs, ainsi que les étiquettes fluorescentes ou diffusion pour permettre une détection spécifique d’une protéine d’intérêt14 , 17 , 19.
En principe, iSCAT fonctionne en amplifiant la faible lumière de la protéine via interférométrique de mélange avec une vague référence secondaire. L’intensité détectée () dans un iSCAT microscope est décrite par
où est l’intensité incidente,
est un coefficient pour la contribution de l’onde de référence,
signifie la force de diffusion de la nano-objet à l’étude, et
est le déphasage entre l’épars et de référence 14de vagues. Soit la transmise ou réfléchie arrière lumière incidente est généralement utilisée comme une onde de référence, où, dans chaque cas
représente la transmissivité ou la réflectivité de la chambre de l’échantillon, respectivement. Le terme
est proportionnelle à la section transversale de diffusion de la protéine et peut être négligé par rapport à l’expression de croix. Ainsi,
pour interférence destructive complète, la lumière détectée est donnée par
où
est l’intensité de référence et
est l’intensité de l’interférence.
la microscopie iSCAT offre une excellente méthode pour l’étude des processus biologiques à l’échelle de la molécule unique. À titre d’exemple, nous étudions les cellules Laz388 — un virus Epstein – Barr (EBV) transformé lymphocyte B cell line20,21 — comme ils sécrètent des protéines telles que les IgG anticorps16. Toutefois, la méthode est générale et peut être appliquée à une variété d’autres systèmes biologiques. iSCAT est intrinsèquement imprécis et peut détecter n’importe quelle protéine ou nanoparticules ou il peut être étendu avec les méthodes courantes de fonctionnalisation de surface pour la détection spécifique ou multiplexée. Sa simplicité et sa capacité à combiner avec d’autres techniques optiques, telles que la microscopie de fluorescence, faire un outil complémentaire précieux iSCAT en biologie cellulaire.
Un des aspects plus cruciaux pour obtenir des données iSCAT utile est la possibilité de trouver la bonne position focale à la surface de la lamelle couvre-objet et, en outre, à occuper ce poste pendant de longues périodes de temps. Faute de quoi se traduira par PSF élargie, signaux faibles iSCAT et artefacts associés à la dérive dans les analyses de la dynamique. Il s’avère que trouver le plan focal sur un lamelle couvre-objet propre et surface n’est pas une tâche facile comme caractéristiques de la surface ne sont pas visibles sur l’arrière-plan de faisceau de référence importante (voir Figure 4 d).
Images RAW iSCAT sont souvent masqués par des signaux de fond qui découlent de front d’onde impuretés dans la source d’excitation et peuvent nuire à sa capacité à trouver le bon plan d’imagerie. Soustraction de front d’onde active est un moyen utile pour contourner ce problème et par la suite surveiller l’accent iSCAT pendant une mesure16. Une façon d’y parvenir est par le biais de modulation spatiale échantillon. En bref, un générateur de fonctions s’applique une onde carrée de 50 Hz pour le port de contrôle externe de la scène de piezo, résultant en une modulation de l’échantillonnage spatial à la fréquence appliquée (amplitude de 290 nm). Acquisitions de caméra synchrone découlent de la même source et, lorsqu’il est combiné par le biais de lock-in principes, aboutir à une compensation de wavefront image14,16. L’image résultante indique généralement la rugosité de la lamelle (Figure 4e). Petits éléments restant sur le verre après que nettoyage peuvent être utilisés pour donner le focus au microscope. Paramètres utilisés pour cette étape de soustraction de fond peuvent être changés selon la cadence, durée d’exposition ou matériels.
Comme mentionné ci-dessus, l’utilisation d’un séparateur de faisceau de haute qualité dans les paramètres iSCAT (étape 1.2.1.) est recommandée, comme l’imagerie d’objets comme les images fantômes ou interférence résultant de séparateurs de faisceau planaire mince influencera l’image et perturber la mesure. La figure 7 montre une comparaison entre un séparateur de faisceau de faible qualité et de haute qualité. Les deux images raw iSCAT montrent la même zone sur la lamelle couvre-objet contenant des particules résiduelles. La même configuration iSCAT a été utilisée pour capturer les deux images, le séparateur de faisceau seulement ont été échangé. Figure 7 a montre l’image formée sur la caméra par l’utilisation d’une plus épaisse (5 mm), séparateur de faisceau revêtement antireflet et coincé. Grâce à la conception coincée, le faisceau réfléchi de la surface arrière de la séparateur de faisceau est antiparallèle à la réflexion résultant de la surface frontale et ne pénètre pas dans l’objectif. Sans artefacts interférences se produisent. Figure 7 b montre le même champ de vision sur l’échantillon, mais cette fois un séparateur de faisceau planaire (1 mm) plus mince a été utilisé. Les deux réflexions des surfaces avant et arrière entre le séparateur de faisceau sont parallèles et se propagent à la caméra. Objets d’interférence sont clairement visibles.
Figure 7 : comparaison d’images iSCAT produites avec séparateurs de faisceau haute et basse-qualité. (a) résultant iSCAT raw image par l’utilisation d’un séparateur de faisceau épais revêtement antireflet et coincé de 5 mm. (b) résultant iSCAT raw image de la même région par l’utilisation d’un séparateur de faisceau planaire épaisse de 1 mm. Les deux séparateurs de faisceau ont le même rapport de fractionnement (réflexion de 50 %, 50 % de transmission). Objets d’interférence dus aux réflexions de Fresnel sont clairement observés dans l’image produite avec le séparateur de faisceau planaire épaisse de 1 mm. Barreaux de l’échelle : 2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Dans ce protocole, nous décrivons un schéma d’éclairage grand-angulaire pour iSCAT car il est rapide, facile à réaliser et permet de détection parallèles sur une vaste zone14. Une autre approche courante consiste à utiliser des déflecteurs acousto-optique (ces OD) et balayez un faisceau confocal sur l’échantillon12,17. Cette approche évite la nécessité d’une réentrée de haute qualité, mais est plus expérimentalement complexe que l’imagerie grand champ conventionnel. En outre, la vitesse d’éclairement confocal est limitée par celle de ces OD. Selon les paramètres expérimentaux souhaités, soit régimes d’éclairement confocale ou grand champ peuvent, en principe, être utilisés pour détecter les protéines simples sécrétées par les cellules vivantes.
Tel que discuté dans tout le protocole, il est impératif de réduire au minimum les fluctuations mécaniques latérales dans le stade de l’échantillon du microscope. Même nanomètre déviations dans la position de l’échantillon peuvent conduisent à des variations dans les trames consécutives caméra et provoquer des bruits significatifs dans l’image différentielle. Il est donc recommandé d’utiliser une platine du microscope mécaniquement stable et une amorti table optique (étape 1.1.1.) et pour couvrir l’installation avec des panneaux ou rideaux optique pendant une expérience (étape 3.5.).
Un régime de stabilisation du foyer actif sont également envisageables pour les mesures à long terme. Dans cette approche, un deuxième laser est incorporé dans le microscope dans un arrangement de réflexion totale interne (TIR) et ensuite projeté sur une photodiode quadrant. Changements dans focus du système se traduisent les déplacements latéraux du laser TIR spot sur la diode de quadrant, qui peut ensuite servir dans une boucle de rétroaction active pour contrôler l’axe z du piezo étape26. Les effets de la dérive verticale à long terme sont ainsi éliminées.
Plusieurs modifications et extensions peuvent être appliquées à la technique présentée pour répondre aux besoins spécifiques expérimentales. Par exemple, les incubateurs de stade commercial microscope sont disponibles qui pourraient facilement être incorporées dans le microscope iSCAT pour l’imagerie à long terme des cellules. Autres techniques peuvent également être implémentées pour compléter iSCAT d’imagerie, telles que confocale ou TIR fluorescence microscopies17. Pour adapter le système à l’étude, la sécrétion iSCAT mesures peuvent être effectuées sur d’autres supports de cellules comme DMEM ou SPD, toutefois, le rouge de phénol indicateur pH il faut éviter car elle peut perturber l’expérience due à l’absorption de la lumière laser. En outre, suppléments comme sérum de veau foetal (FCS) ou humain lysat de plaquettes (hPL) contiennent des protéines qui peuvent interférer avec la détection iSCAT. Fonction de la sensibilité désirée de l’expérience, ces suppléments devraient être exclues de la moyen de la microscopie.
iSCAT s’appuie sur la capacité de l’analyte à la lumière de nuages de points XY — une propriété qui fait partie intégrante de toutes les protéines — et n’est donc par nature non spécifique. Néanmoins, une certaine spécificité est possible comme échelle de signaux iSCAT linéairement avec la protéine masse14,27,28. Cela permet l’étalonnage d’un système d’iSCAT en utilisant des échantillons de protéine standard, tels que l’albumine sérique bovine (BSA) et fibrinogène14,27,28. En effet, très récemment, Young et al. 28 ont étendu sur les travaux de Piliarik & Sandoghdar14 et ont montré qu’iSCAT peut être utilisé pour déterminer le poids moléculaire des protéines aussi petits que streptavidine (53 kDa) avec une résolution massive de 19 kDa et une précision d’environ 5 kDa. Plusieurs approches conventionnelles peuvent compléter encore iSCAT en fournissant un niveau supplémentaire de spécificité. Comme un exemple, dosages immuno-enzymatiques (ELISA), et/ou autres modifications de surface, restreignent protéine liant les événements afin que seule la protéine-cible est détecté16.
Dans ce protocole, nous décrit comment les iSCAT microscopie peut être utilisée pour étudier des sécrétions cellulaires au niveau de la seule protéine avec résolution temporelle de subsecond16. La technique est générale et peut être exécutée sur n’importe quel microscope commercial ou maison construite. Contrairement aux approches de la fluorescence des molécules simples, la méthode ne souffre pas de photoblanchiment ou clignotement des effets, mais il atteint sensibilité unique-protéine. Ces caractéristiques font d’iSCAT un outil puissant dans le domaine des biocapteurs et microscopie. Les applications futures porteront sur élucider les interactions cellulaires complexes tels que la réponse immunologique à un stimulus ou de la communication cellulaire.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck, un poste de professeur Alexander-von-Humboldt et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Nous remercions Stefanie Schaffer Universitätsklinikum Erlangen pour fournir les cellules Laz388 et des discussions fructueuses. Nous remercions Simone Ihloff et Maksim Schwab à MPL pour le support technique.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |